Enzymkatalyse

Deze conformatieveranderingen brengen ook katalytische residuen in de actieve site dicht bij de chemische bindingen in het substraat die in de reactie zullen worden gewijzigd. Nadat de binding heeft plaatsgevonden, verlagen een of meer katalytische mechanismen de energie van de overgangstoestand van de reactie, door een alternatieve chemische route voor de reactie te bieden. Er zijn zes mogelijke mechanismen van “over de barrière heen”-katalyse, alsmede een “door de barrière heen”-mechanisme:

Nabijheid en oriëntatieEdit

Enzym-substraat-interacties brengen de reactieve chemische groepen op één lijn en houden ze dicht bij elkaar in een optimale geometrie, waardoor de snelheid van de reactie toeneemt. Dit verlaagt de entropie van de reactanten en maakt dus additie- of overdrachtsreacties minder ongunstig, omdat de totale entropie afneemt wanneer twee reactanten een enkel product worden. Dit is echter een algemeen effect dat ook optreedt bij reacties zonder additie of overdracht, waar het optreedt door een toename van de “effectieve concentratie” van de reagentia. Dit wordt begrepen wanneer men nagaat hoe een toename van de concentratie tot een toename van de reactiesnelheid leidt: in wezen botsen de reagentia vaker wanneer zij geconcentreerder zijn, en reageren zij dus vaker. Bij enzymkatalyse beperkt de binding van de reagentia aan het enzym de conformatieruimte van de reagentia, waardoor zij in de “juiste oriëntatie” en dicht bij elkaar worden gehouden, zodat zij vaker en met de juiste geometrie tegen elkaar botsen om de gewenste reactie mogelijk te maken. De “effectieve concentratie” is de concentratie die de reactant zou moeten hebben, vrij in oplossing, om dezelfde botsingsfrequentie te ervaren. Vaak zijn dergelijke theoretische effectieve concentraties onfysisch en in werkelijkheid onmogelijk te realiseren – wat een bewijs is voor de grote katalytische kracht van veel enzymen, met enorme snelheidsverhogingen ten opzichte van de ongekatalyseerde toestand.

Bijvoorbeeld:

Gelijksoortige reacties zullen veel sneller verlopen als de reactie intramoleculair is.

De effectieve concentratie van acetaat in de intramoleculaire reactie kan worden geschat als k2/k1 = 2 x 105 molair.

De situatie kan echter complexer zijn, aangezien moderne computationele studies hebben aangetoond dat traditionele voorbeelden van nabijheidseffecten niet rechtstreeks in verband kunnen worden gebracht met entropische effecten van enzymen. Ook is gebleken dat het oorspronkelijke entropische voorstel de bijdrage van oriëntatie-entropie aan de katalyse ruim overschat.

Proton-donors of -acceptorsEdit

Proton donors en acceptors, d.w.z. zuren en basen kunnen protonen doneren en accepteren om zich ontwikkelende ladingen in de overgangstoestand te stabiliseren. Dit houdt verband met het algemene principe van katalyse, namelijk het verlagen van energiebarrières, aangezien overgangstoestanden in het algemeen hoge energie-toestanden zijn, en door ze te stabiliseren wordt deze hoge energie verlaagd, waardoor de barrière wordt verlaagd. Een belangrijk kenmerk van enzymkatalyse ten opzichte van veel niet-biologische katalyse, is dat zowel zure als basische katalyse in dezelfde reactie kunnen worden gecombineerd. In veel abiotische systemen kunnen zuren (grote concentraties) of basen (grote concentraties H+ putten, of soorten met elektronenparen) de snelheid van de reactie verhogen; maar het milieu kan natuurlijk maar één algemene pH hebben (maat voor zuurgraad of basischheid (alkaliteit)). Maar omdat enzymen grote moleculen zijn, kunnen zij zowel zure groepen als basische groepen in hun actieve site plaatsen om met hun substraten te interageren, en beide modi gebruiken onafhankelijk van de bulk pH.

Vaak wordt algemene zure of basische katalyse gebruikt om nucleofiele en/of elektrofiele groepen te activeren, of om vertrekkende groepen te stabiliseren. Veel aminozuren met zure of basische groepen worden hierbij in de actieve zone gebruikt, zoals glutamine- en asparaginezuur, histidine, cystine, tyrosine, lysine en arginine, alsmede serine en threonine. Daarnaast wordt vaak gebruik gemaakt van de peptide ruggengraat, met carbonyl en amide N groepen. Cystine en histidine zijn zeer vaak betrokken, omdat zij beide een pKa dicht bij de neutrale pH hebben en dus zowel protonen kunnen accepteren als afstaan.

Veel reactiemechanismen met zuur/base katalyse gaan uit van een sterk veranderde pKa. Deze wijziging van pKa is mogelijk door de lokale omgeving van het residu.

Voorwaarden	Zuren	Basen
Hydrofoob milieu	Verhoogt pKa	Verlaagt pKa
Aangerenzende residu’s met gelijke lading	Verhoogt pKa	Verlaging pKa
Zoutbrug- (en waterstof binding-)vorming	Verlaging pKa	Verhoging pKa

pKa kan ook aanzienlijk worden beïnvloed door het omringende milieu, in die mate dat residuen die in oplossing basisch zijn, als proton-donor kunnen fungeren, en omgekeerd.

Bijvoorbeeld:

Katalytische triade van een serine protease

De eerste stap van het katalytische mechanisme van serine protease houdt in dat het histidine van de actieve site een proton accepteert van het serine-residu. Hierdoor wordt het serine als nucleofiel voorbereid om de amidebinding van het substraat aan te vallen. Dit mechanisme omvat donatie van een proton van serine (een base, pKa 14) aan histidine (een zuur, pKa 6), mogelijk gemaakt door de lokale omgeving van de basen.

Het is belangrijk te verduidelijken dat de wijziging van de pKa’s een zuiver onderdeel is van het elektrostatische mechanisme. Bovendien is het katalytische effect van bovenstaand voorbeeld voornamelijk geassocieerd met de verlaging van de pKa van het oxyanion en de verhoging van de pKa van het histidine, terwijl de protonoverdracht van het serine naar het histidine niet noemenswaardig wordt gekatalyseerd, aangezien dit niet de snelheidsbepalende barrière is.

Elektrostatische katalyseEdit

Stabilisatie van geladen overgangstoestanden kan ook geschieden door residuen in de actieve site die ionische bindingen (of partiële ionische ladingsinteracties) vormen met het tussenproduct. Deze bindingen kunnen afkomstig zijn van zure of basische zijketens van aminozuren zoals lysine, arginine, asparaginezuur of glutaminezuur of van metaalcofactoren zoals zink. Metaalionen zijn bijzonder effectief en kunnen de pKa van water voldoende verlagen om er een effectief nucleofiel van te maken.

Systematische computersimulatiestudies stelden vast dat elektrostatische effecten verreweg de grootste bijdrage leveren aan de katalyse. Zij kunnen de reactiesnelheid met een factor tot 107 verhogen. In het bijzonder is gebleken dat enzymen een omgeving bieden die polairder is dan water, en dat de ionische overgangstoestanden worden gestabiliseerd door vaste dipolen. Dit is heel anders dan bij de stabilisatie van de overgangstoestand in water, waar de watermoleculen het moeten stellen met “reorganisatie-energie”. om ionische en geladen toestanden te stabiliseren. Aldus wordt de katalyse in verband gebracht met het feit dat de polaire groepen van het enzym voorgeorganiseerd zijn

De grootte van het elektrostatische veld dat door de actieve site van een enzym wordt uitgeoefend, blijkt in hoge mate gecorreleerd te zijn met de katalytische snelheidsverhoging van het enzym

Binding van substraat sluit gewoonlijk water uit de actieve site uit, waardoor de plaatselijke diëlektrische constante wordt verlaagd tot die van een organisch oplosmiddel. Dit versterkt de elektrostatische interacties tussen de geladen/polaire substraten en de actieve sites. Bovendien hebben studies aangetoond dat de ladingsdistributies rond de actieve sites zodanig gerangschikt zijn dat ze de overgangstoestanden van de gekatalyseerde reacties stabiliseren. In diverse enzymen dienen deze ladingsverdelingen kennelijk om polaire substraten naar hun bindingsplaatsen te leiden, zodat de snelheid van deze enzymreacties groter is dan hun schijnbare diffusiegecontroleerde grenzen.

Bijvoorbeeld:

Carboxypeptidase katalytisch mechanisme

Het tetrahedrale intermediair wordt gestabiliseerd door een partiële ionische binding tussen het Zn2+-ion en de negatieve lading op de zuurstof.

Covalente katalyseEdit

Covalente katalyse houdt in dat het substraat een transiënte covalente binding vormt met residuen in de actieve site van het enzym of met een cofactor. Dit voegt een extra covalent tussenproduct aan de reactie toe, en helpt de energie van latere overgangstoestanden van de reactie te verminderen. De covalente binding moet in een later stadium van de reactie worden verbroken om het enzym te regenereren. Dit mechanisme wordt gebruikt door de katalytische triade van enzymen, zoals proteasen als chymotrypsine en trypsine, waarbij een tussenproduct van een acyl-enzym wordt gevormd. Een alternatief mechanisme is de vorming van een schiff base met behulp van het vrije amine van een lysineresidu, zoals bij het enzym aldolase tijdens de glycolyse.

Sommige enzymen gebruiken cofactoren die geen aminozuur bevatten, zoals pyridoxaalfosfaat (PLP) of thiaminepyrofosfaat (TPP), om covalente tussenproducten te vormen met reactormoleculen. Dergelijke covalente tussenproducten verminderen de energie van latere overgangstoestanden, net zoals covalente tussenproducten die gevormd worden met actieve aminozuurresiduen stabilisatie mogelijk maken, maar de mogelijkheden van cofactoren stellen enzymen in staat reacties uit te voeren die aminozuur-zijresiduen alleen niet zouden kunnen uitvoeren. Enzymen die dergelijke cofactoren gebruiken zijn onder andere het PLP-afhankelijke enzym aspartaattransaminase en het TPP-afhankelijke enzym pyruvaatdehydrogenase.

In plaats van de activeringsenergie voor een reactieweg te verlagen, biedt covalente katalyse een alternatieve weg voor de reactie (via het covalente tussenproduct) en is dus te onderscheiden van echte katalyse. Bijvoorbeeld, de energetica van de covalente binding aan het serinemolecuul in chymotrypsine moet worden vergeleken met de welbegrepen covalente binding aan het nucleofiel in de ongekatalyseerde oplossingsreactie. Een echt voorstel van een covalente katalyse (waarbij de barrière lager is dan de overeenkomstige barrière in oplossing) zou bijvoorbeeld een partiële covalente binding aan de overgangstoestand door een enzymgroep vereisen (b.v. een zeer sterke waterstofbrug), en dergelijke effecten dragen niet significant bij aan de katalyse.

MetaalionkatalyseEdit

Een metaalion in de actieve site neemt deel aan de katalyse door het coördineren van ladingsstabilisatie en afscherming. Vanwege de positieve lading van een metaal kunnen alleen negatieve ladingen door metaalionen worden gestabiliseerd. Metaalionen zijn echter voordelig in biologische katalyse omdat zij niet worden beïnvloed door veranderingen in pH. Metaalionen kunnen ook optreden om water te ioniseren door als Lewiszuur te fungeren. Metaalionen kunnen ook oxidatie- en reductiemiddelen zijn.

BindingsspanningEdit

Dit is het belangrijkste effect van geïnduceerde fit-binding, waarbij de affiniteit van het enzym voor de overgangstoestand groter is dan voor het substraat zelf. Dit induceert structurele herschikkingen die de substraatbindingen in een positie dichter bij de conformatie van de overgangstoestand rekken, zodat het energieverschil tussen het substraat en de overgangstoestand wordt verlaagd en de reactie wordt gekatalyseerd.

Het rekeffect is echter in feite een destabilisatie-effect van de grondtoestand, eerder dan een stabilisatie-effect van de overgangstoestand. Bovendien zijn enzymen zeer flexibel en kunnen zij geen groot vervormingseffect toepassen.

Naast vervorming van bindingen in het substraat, kan vervorming van bindingen ook worden geïnduceerd in het enzym zelf om residuen in de actieve site te activeren.

Bijvoorbeeld:

Substraat, gebonden substraat, en overgangstoestandconformatie van lysozym.

Het substraat, bij binding, wordt vervormd van de halve stoelconformatie van de hexose ring (vanwege de sterische hinder met aminozuren van het eiwit die de equatoriale c6 dwingen zich in de axiale positie te bevinden) naar de stoelconformatie

KwantumtunnelingEdit

Deze traditionele “over de barrière”-mechanismen zijn in sommige gevallen in twijfel getrokken door modellen en waarnemingen van “door de barrière heen”-mechanismen (kwantumtunneling). Sommige enzymen werken met een kinetiek die sneller is dan wat door de klassieke ΔG‡ zou worden voorspeld. In “door de barrière heen”-modellen kan een proton of een elektron door activeringsbarrières heen tunnelen. Kwantumtunneling voor protonen is waargenomen bij tryptamine-oxidatie door aromatische amine dehydrogenase.

Quantumtunneling lijkt geen groot katalytisch voordeel op te leveren, omdat de tunnelbijdragen vergelijkbaar zijn in de gekatalyseerde en de ongekatalyseerde reacties in oplossing. Maar de tunnelbijdrage (die typisch de snelheidsconstanten met een factor ~1000 verhoogt in vergelijking met de reactiesnelheid voor de klassieke “over de barrière”-route) is waarschijnlijk van cruciaal belang voor de levensvatbaarheid van biologische organismen. Dit benadrukt het algemene belang van tunnelreacties in de biologie.

In 1971-1972 werd het eerste kwantummechanische model van enzymkatalyse geformuleerd.

Actief enzymEdit

De bindingsenergie van het enzym-substraatcomplex kan niet worden beschouwd als een externe energie die nodig is voor de activering van het substraat. Het enzym met een hoge energie-inhoud kan eerst een specifieke energetische groep X1 van de katalytische site van het enzym overbrengen naar de uiteindelijke plaats van het eerste gebonden reagens, dan moet een andere groep X2 van het tweede gebonden reagens (of van de tweede groep van het enkele reagens) worden overgebracht naar de actieve site om de omzetting van substraat in product en de regeneratie van het enzym te voltooien.

We kunnen de hele enzymreactie voorstellen als een tweetal koppelingsreacties:

S 1 + EX 1 ⟶ S 1 EX 1 ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {{S1}+ EX1 -> S1EX1 -> {P1}+ EP2}}

(1)

S 2 + EP 2 ⟶ S 2 EP 2 ⟶ P 2 + EX 2 {{S2}+ EP2 -}> S2EP2 -> {P2}+ EX2}}

(2)

Uit reactie (1) blijkt dat de groep X1 van het actieve enzym in het product voorkomt als gevolg van de mogelijkheid van de uitwisselingsreactie binnen het enzym om zowel elektrostatische remming als afstoting van atomen te voorkomen. Dus stellen we het actieve enzym voor als een krachtige reactant van de enzymatische reactie. De reactie (2) laat een onvolledige omzetting van het substraat zien, omdat de groep X2 binnen het enzym blijft. Deze benadering als idee was vroeger voorgesteld steunend op de hypothetische extreem hoge enzymatische omzettingen (katalytisch volmaakt enzym).

Het cruciale punt voor de verificatie van de huidige benadering is dat de katalysator een complex moet zijn van het enzym met de overdrachtsgroep van de reactie. Dit chemische aspect wordt ondersteund door de goed bestudeerde mechanismen van de verschillende enzymatische reacties. Beschouw de reactie van peptidebindinghydrolyse gekatalyseerd door een zuiver eiwit α-chymotrypsine (een enzym dat zonder cofactor werkt), dat een goed bestudeerd lid is van de familie van serine proteasen, zie.

We presenteren de experimentele resultaten voor deze reactie als twee chemische stappen:

S 1 + EH ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {{S1}+ EH -> {P1}+ EP2}}

(3)

EP 2 + H – O – H ⟶ EH + P 2 {\displaystyle {{EP2}+ {H-O-H}-> {EH}+ P2}}

(4)

waar S1 een polypeptide is, P1 en P2 producten zijn. De eerste chemische stap (3) omvat de vorming van een covalent acyl-enzymtussenproduct. De tweede stap (4) is de deacylatiestap. Het is belangrijk op te merken dat de groep H+, die aanvankelijk op het enzym voorkomt, maar niet in water, in het product verschijnt vóór de hydrolysestap, en daarom kan worden beschouwd als een extra groep van de enzymreactie.

Dus toont de reactie (3) aan dat het enzym als een krachtige reactant van de reactie optreedt. Volgens het voorgestelde concept bevordert het H-transport van het enzym de eerste omzetting van de reactant, de afbraak van de eerste initiële chemische binding (tussen de groepen P1 en P2). De stap van hydrolyse leidt tot afbraak van de tweede chemische binding en regeneratie van het enzym.

Het voorgestelde chemische mechanisme is niet afhankelijk van de concentratie van de substraten of producten in het medium. Een verschuiving in hun concentratie veroorzaakt echter voornamelijk vrije-energiewijzigingen in de eerste en laatste stappen van de reacties (1) en (2) als gevolg van de veranderingen in de vrije-energie-inhoud van elk molecuul, of het nu S of P is, in de wateroplossing.Deze benadering is in overeenstemming met het volgende mechanisme van spiercontractie. De laatste stap van ATP-hydrolyse in skeletspieren is het vrijkomen van het product dat veroorzaakt wordt door de binding van myosinekoppen met actine. Het sluiten van de actine-bindende spleet tijdens de associatiereactie is structureel gekoppeld aan het openen van de nucleotide-bindende zak op de actieve plaats van myosine.

Met name de laatste stappen van ATP-hydrolyse omvatten de snelle vrijgave van fosfaat en de langzame vrijgave van ADP.Het vrijkomen van een fosfaatanion uit het gebonden ADP-anion in de wateroplossing kan worden beschouwd als een exergonische reactie omdat het fosfaatanion een lage molecuulmassa heeft.

Dus komen we tot de conclusie dat het primair vrijkomen van het anorganische fosfaat H2PO4- leidt tot omzetting van een belangrijk deel van de vrije energie van ATP-hydrolyse in de kinetische energie van het opgeloste fosfaat, waardoor actieve stroming ontstaat. Deze veronderstelling van een lokale mechano-chemische transductie is in overeenstemming met Tirosh’s mechanisme van spiercontractie, waar de spierkracht voortkomt uit een geïntegreerde actie van actieve stroming gecreëerd door ATP hydrolyse.