Enteropathogenen geassocieerd met diarree bij zuigelingen in arme stadswijken van Porto Velho, Rondônia: een voorstudie

Enteropathogenen geassocieerd met diarree bij zuigelingen in arme stadswijken van Porto Velho, Rondônia: een voorstudie

Vol. 96(5): 621-625, Jul 2001

Patrícia Puccinelli Orlandi+, Tatiane Silva, Gleiciene Felix Magalhães, Fabiana Alves, Roberto Penna de Almeida Cunha, Rui Durlacher, Luiz Hildebrando Pereira da Silva

Centro de Pesquisa em Medicina Tropical, Rodovia BR 364, km 4.5, 78970-900 Porto Velho, RO, Brasil

Honderddertig gevallen van diarree en 43 leeftijdsgenoten controles, 0 tot 5 jaar oud, werden bestudeerd in een pediatrische polikliniek uit een arm peri urban gebied van Porto Velho, Rondônia. Tachtig procent van de diarreegevallen werd waargenomen in de groepen jonger dan 2 jaar. Rotavirus (19,2%) was de meest frequente enteropathogeen geassocieerd met diarree, gevolgd door Shigella flexneri (6,15%) en S. sonnei (1,5%) en Salmonella sp. (6,9%). Vier gevallen van E. coli enterotoxigene infecties (3,1%), E. coli enteropathogene (EPEC) (2,3%) één geval van E. coli entero-invasieve infectie (0,8%) en één geval van Yersinia enterocolitica (0,8%) werden ook vastgesteld. Gemengde infecties kwamen frequent voor, waarbij rotavirus, EPEC en Salmonella sp. geassocieerd werden met Entamoeba histolytica en Giardia lamblia.

Trefwoorden: diarree – enteropathogenen – rotavirusinfecties – epidemiologie – Rondônia – Brazilië

Diarreeziekte is verantwoordelijk voor naar schatting vijf miljoen sterfgevallen per jaar onder zuigelingen jonger dan 5 jaar over de hele wereld (Georges et al. 1984). De belangrijkste risicofactoren voor de morbi-mortaliteit van diarree zijn welbekend en houden verband met de slechte levenskwaliteit en het gebrek aan sanitaire voorzieningen en schoon water voor het grootste deel van de bevolking die in arme gebieden van ontwikkelingslanden woont.

Verslagen tonen aan dat diarree een belangrijke kinderziekte is in veel gebieden van Latijns-Amerikaanse landen en verantwoordelijk is voor meer dan 20% van de kindersterfte (Bern et al. 1992). In Brazilië komt diarree in het gehele land voor en vormt nog steeds een belangrijke oorzaak van kindersterfte in de armste periurbane en plattelandsgebieden van zowel de noordoostelijke als de noordelijke regio’s (Guerrant & Kirchhoff 1983).

Een longitudinale studie, uitgevoerd van 1990 tot 1992 in de stad Belém, in het oostelijk Amazonegebied, leverde percentages van 5,9 episodes van diarree per kind/jaar op (Linhares 1997).

Minder recente gegevens uit Fortaleza, in de noordoostelijke regio van het land, toonden aan dat het aantal diarree-episoden in de leeftijdsgroep van 6 tot 12 maanden meer dan 7 en 9 per persoon per jaar bedraagt bij gezinnen in de arme stedelijke gebieden en op het arme platteland, respectievelijk, en geleidelijk afneemt tot twee episoden per persoon per jaar bij de volwassenen (Guerrant & Kirchhoff 1983). Tot op heden is er in Rondônia en in het westelijk Amazonegebied geen onderzoek gedaan naar de incidentie van diarree, maar uit gegevens van de officiële gezondheidsdiensten blijkt dat diarree de belangrijkste oorzaak is van sterfte onder kinderen van 0 tot 5 jaar (Plano Plurianual de Saúde de Rondônia 1996).

In de zuidelijke en zuidoostelijke streken van Brazilië zijn verscheidene studies verricht om etiologische agentia te identificeren die met diarree in verband worden gebracht, en om zowel de epidemiologische als de klinische kenmerken van de ziekte te beoordelen (Riley et al. 1984, Trabulsi et al. 1985a, Gomes et al. 1991). Enkele studies zijn uitgevoerd in de noordoostelijke regio, met name in Fortaleza (Guerrant & Kirchhoff 1983) en Recife (Leal et al. 1988). In het noordelijk Amazonegebied van Brazilië is geen enkele studie verricht, met uitzondering van specifieke studies over rotavirus in Belém.

Wij presenteren hier voorlopige gegevens over de etiologie en klinische kenmerken van diarree bij zuigelingen van 0 tot 5 jaar oud, wonend in een arm stedelijk gebied, die verwezen werden naar een pediatrische, poliklinische eenheid in Porto Velho, Rondônia (westelijk Amazonegebied). De relatieve frequenties van de enteropathogenen zijn vergelijkbaar met die beschreven in de noordoostelijke regio van Brazilië.

MATERIALEN EN METHODEN

RESULTATEN

DISCUSSIE

ACKNOWLEDGMENTS

MATERIALEN EN METHODEN

Studiegebied – De studie werd uitgevoerd tussen juli 1998 en maart 1999 door het personeel van het “Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEPEM)”, Porto Velho, in de poliklinische gezondheidseenheid “Policlínica Hamilton Gondin”. In Porto Velho, de hoofdstad, is de bevolking de laatste drie decennia aanzienlijk toegenomen als gevolg van migratie uit verschillende gebieden van Brazilië na de aanleg van de weg “BR364”, die de stad verbindt met de regio’s Centraal- en Zuid-Brazilië. De huidige bevolking van de stad bedraagt ongeveer 200.000 inwoners. De stad heeft een modern geometrisch ontwerp maar beschikt niet over een adequaat rioleringssysteem. De “Policlínica” bevindt zich in de arme noordelijke stadsrand. De drinkwatervoorziening is beperkt tot een klein deel van de oude woningen en er is geen rioleringsnet, elk huis heeft een puttoilet.

Studie-overzicht – Honderddertig zuigelingen van 0 tot 5 jaar oud werden door moeders naar de “Policlínica” gebracht vanwege diarree; daarnaast werden 43 leeftijdsgelijkende niet-diarree controle zuigelingen van naar de “Policlínica” geselecteerd voor de studie. Kinderartsen van CEPEM interviewden de begeleidende volwassenen, verkregen schriftelijke geïnformeerde toestemming, vulden een vragenlijst in en voerden lichamelijk onderzoek uit. Speciale aandacht werd besteed aan de voorgeschiedenis van de symptomen, het aantal episoden van diarree, koorts (okseltemperatuur > 37o.8), braken, dehydratie en de aanwezigheid van slijm en bloed in de ontlasting.

Laboratoriummethoden – Ontlastingsmonsters werden verzameld na natuurlijke evacuatie of door stimulatie met een glycerine zetpil. De monsters werden verdeeld in twee fracties: één fractie werd gebruikt voor parasitologisch onderzoek en het testen op rotavirus met behulp van Slidex Kit (Biomerieux). Het tweede aliquot werd gekweekt volgens standaard bacteriologische procedures. Kort gezegd werd ongeveer 3 g ontlasting gesuspendeerd in 3 ml PBS en op de volgende selectieve media gelegd: MacConkey, SS en brilliant green agar (na aanrijking in tetrathionaatbouillon met 40 µg/ml novobiocine) voor isolatie en identificatie van de volgende enteropathogene bacteriën: enteropathogene Escherichia coli (EPEC), enterohemorrhagische (Shiga-like toxin-producerende) E. coli (EHEC), entero-invasieve E. coli (EIEC), Shigella, Salmonella sp, Yersinia species, Campylobacter jejuni en C. coli. De platen werden gedurende 24-48 uur bij 37oC geïncubeerd, behalve de platen die werden gebruikt voor de identificatie van Campylobacter-soorten; deze werden gedetecteerd met behulp van platen met gemodificeerde Skirrow, gevolgd door incubatie bij 42oC gedurende 48 uur in een Gaspak-pot.

Vijf positieve kolonies die typisch zijn voor E. coli en één lactose-negatieve kolonie van verschillende morfologische types werden gekweekt op MacConkey-agarplaten, evenals lactose-positieve en -negatieve kolonies geïsoleerd op SS- en briljantgroene agarplaten werden geïdentificeerd door middel van biochemische tests met behulp van een EPM-millicitraatkit (ProBac, Brasil). Op gemodificeerde Skirrow-platen groeiende kolonies die op Campylobacter-soorten leken, werden onderworpen aan Gram-kleuringstests en katalase- en oxidasetests ter bevestiging van het genus. E. coli-stammen geïsoleerd op MacConkey-agar werden onderworpen aan plaatjesagglutinatietests met polyvalente sera tegen EPEC-serogroepen A, B en C. Niet-agglutinerende isolaten werden getest met antiserum tegen EHEC-serogroep O157 en met polyvalente antisera tegen EIEC-serogroepen A en B. Isolaten die door biochemische tests als Shigella- en Yersinia-soorten werden geïdentificeerd, werden met standaardtechnieken geserotypeerd. Commercieel beschikbare antisera van ProBac en Promicro (São Paulo) werden gebruikt voor serotypenbepalingen.

E. coli-isolaten die niet behoorden tot de serotypes EPEC, EHEC of EIEC werden getest op de productie van heat-labile enterotoxine (LT), en heat stabile (ST) enterotoxine door PCR. De gebruikte primers (Tornieporth et al. 1995) zijn complementair aan de volgende posities:

59 tot 76 (ET-LT1,5’GCGACAAATTATACCGTGCT3′)

765 tot 746 (ET-LT2,5’GCGACAAATTATACCGTGCT3′)

79 tot 98 (ET-ST1,5’CTGTATTGTTTCACCT3′) en

260 tot 241 (ET-ST2, 5’GCACCCGGTACAAGCAGGAT3′).

De amplificatie werd uitgevoerd door 30 cycli in een thermische cycler van Perkin-Elmer, als volgt: denaturatie gedurende 2 min bij 92ºC, annealing gedurende 1 min bij 50oC, en extensie gedurende 2 min bij 72ºC. Het amplificatieproces werd afgesloten met een extensie van 5 minuten bij 72ºC, waarna de buisjes snel werden afgekoeld bij 4oC. Vijftien µl van elk monster werd onderworpen aan elektroforese op een 2% ethidiumbromide-behandelde agarosegel bij 100 V gedurende 2 uur om het PCR-product te visualiseren.

RESULTATEN

Verspreiding van diarree in leeftijdsgroepen – In de “Policlínica” werd een duidelijk hogere incidentie in de leeftijdsgroepen van 0 tot 2 jaar waargenomen onder de 130 gevallen van diarreeziekte. Vooral zuigelingen jonger dan 1 jaar werden getroffen: 62 gevallen (47,7%), waarvan 28 (21,4%) jonger waren dan 6 maanden (tabel I).

Prevalentie van enteropathogenen – Onder de 130 gevallen van diarree waren de laboratoriumonderzoeken negatief voor enteropathogene bacteriën en rotavirus bij 16 zuigelingen. Tabel II toont de verdeling van de pathogenen gevonden in de ontlasting van 53 zuigelingen met diarree (40,7%) en in 2 controles (4,6%). Rotavirus was de meest frequente gevonden ziekteverwekker (19,2% van de diarreegevallen en 2,4% van de controles). Shigella werd aangetroffen in 10 gevallen (7,7%) en niet bij de controles, met een hoge frequentie van S. flexneri (8/10) in verhouding tot S. sonnei (2/10). Salmonella sp. werd aangetroffen in 9 gevallen (6,9% van de diarreegevallen en 1 controle – 2,4%). ETEC werd aangetroffen in 4 diarreegevallen, die allemaal zowel LT- als ST-enterotoxinen hadden. EPEC werd aangetroffen in 3 diarreegevallen (2 E. coli O111 en 1 E. coli O125). Bij kinderen met diarree werden 1 geval met EIEC en 1 geval met Y. enterocolitica vastgesteld. Campylobacter werd zowel bij de diarreegevallen als bij de controles gevonden. Parasitologisch onderzoek toonde in 8 gevallen van diarree cysten van E. histolytica. Cysten van G. lamblia werden gevonden in 19 gevallen van diarree en in 4 controles. Gemengde infecties kwamen relatief vaak voor met de volgende verdeling: 2 gevallen van infecties door S. flexneri en rotavirus; 3 gevallen van infecties waarbij Salmonella sp. en G. lamblia betrokken waren, en 2 gevallen van gelijktijdige infectie door EPEC en E. histolytica.

Leeftijdsverdelingen – De leeftijdsgroepverdeling van de verschillende enteropathogenen die in verband met de 114 gevallen van diarree werden aangetroffen, wordt in de figuur weergegeven. Zoals reeds aangetoond in tabel I, kwam 80,5% van de diarree-episoden voor in leeftijdsgroepen jonger dan 2 jaar. Rotavirus-positiviteitspercentages zijn even hoog bij zuigelingen jonger dan 1 jaar, als in de leeftijdsgroep van 1-2 jaar. Andere ziekteverwekkers komen in alle leeftijdsgroepen voor, maar hun verwante frequenties kunnen niet worden bepaald gezien het lage aantal diarreegevallen waargenomen bij kinderen ouder dan 2 jaar.

Epidemiologische en klinische kenmerken – Terwijl alle bacteriële pathogenen in gelijke mate werden aangetroffen in diarreegevallen gedurende de gehele studieperiode, was het aantal rotavirus-positieve gevallen, 70%, hoger in de periode oktober-februari (regenseizoen) dan die tussen mei en september (droog seizoen). Klinische tekenen en symptomen die door de kinderartsen bij opname werden vastgesteld, zijn samengevat in Tabel III; informatie van begeleidende volwassenen over braken is eveneens opgenomen. Koorts bleek vaker voor te komen bij rotavirusinfecties (60% c2 14,85, P= 0,011, 5df) dan de aanwezigheid van bloed in de ontlasting een veel voorkomende bevinding was bij S. sonnei-infecties (80% c2 36,45, P= 0,00001 5df), evenals het optreden van braken (c2 18,84, P=0,002). De aanwezigheid van slijm in de ontlasting werd waargenomen in alle diarreegevallen, ongeacht de etiologie.

DISCUSSIE

In de huidige studie werden 130 gevallen van diarree en 43 leeftijdsgeëvenaarde controles in de leeftijdsgroep van 0 tot 5 jaar oud bestudeerd op een pediatrische polikliniek in het peri stedelijke gebied van Porto Velho. De diarreegevallen waren geconcentreerd in de leeftijdsgroepen jonger dan 2 jaar (80%), wat wijst op de progressieve ontwikkeling van immuniteit tegen enteropathogenen. Aangezien de diarreegevallen passief werden opgespoord, kan de gewoonte van de ouders en de samenleving om meer aandacht te besteden aan jongere kinderen, een gedeeltelijke verklaring zijn voor de waargenomen vertekening in de leeftijdsverdeling van de gevallen. Bij een longitudinaal onderzoek in Fortaleza, waarbij actief naar diarreegevallen werd gezocht, werd een soortgelijke leeftijdsverdeling waargenomen (Guerrant & Kirchhoff 1983), hetgeen bevestigt dat immuniteit een belangrijke rol speelt bij de verklaring van het leeftijdsverdelingsprofiel.

Wat betreft de enteropathogenen geassocieerd in de diarree episodes, werd in de Porto Velho steekproef een hoge prevalentie van rotavirus gevonden (19.2% van de diarree gevallen en 2.4% van de controles).

Rotavirus is de meest frequente enteropathogeen die in de drie bestudeerde regio’s werd aangetroffen (ongeveer 20%). In Porto Velho, zoals reeds waargenomen in São Paulo (Trabulsi et al. 1985) en Belém (Linhares 1997), wordt rotavirus vaker geassocieerd met koorts (60% van de gevallen in Porto Velho).

ETEC was de meest frequente subgroep van E. coli geassocieerd met diarree in het Guerrants’ Fortaleza-onderzoek, terwijl het verantwoordelijk was voor een lager aandeel van patiënten in Trabulsi’s onderzoek in São Paulo (Trabulsi et al. 1985b) en in het huidige onderzoek in Porto Velho. Terwijl LT-toxine-positieve E. coli-stammen steeds werden aangetroffen in de monsters van São Paulo en Fortaleza, werden zowel LT- als ST-toxinen aangetroffen in de vier ETEC-isolaten van Porto Velho.

Salmonella- en Shigella-infecties, zeldzaam in de São Paulo-onderzoeken (Gomes et al. 1991), komen vaker voor in het noordoosten (Guerrant & Kirchhoff 1983) en in Porto Velho, waar ze werden geassocieerd met respectievelijk 6,9% en 7,7% van de diarree-episodes. Shigella-infecties, die even vaak voorkomen in andere ontwikkelingslanden zoals Zuid-Afrika (Scragg et al. 1978), Mexico (Munhoz et al. 1979) en Bangladesh (Stool et al. 1982) zijn verantwoordelijk voor de ernstigste vormen van diarree en gingen in het monster van Porto Velho vaak gepaard met braken (90%) en de aanwezigheid van bloed in de ontlasting (80%), wat wijst op een ernstige beschadiging van het darmslijmvlies.

Bij de diarreegevallen in Porto Velho werd geen enkel geval van infectie met Campylobacter aangetroffen, terwijl deze enteropathogeen in São Paulo veelvuldig wordt waargenomen (Gomes et al. 1991). Eén geval van diarree in verband met Y. enterocolitica werd waargenomen in het monster van Porto Velho. Hoewel reeds beschreven bij diarreegevallen in Rio de Janeiro, werd Y. enterocolytica zelden aangetroffen in andere gebieden. Het is de moeite waard op te merken dat het vaak geassocieerd wordt met diarree in Canada, wat een betere aanpassing van deze soort aan een koude omgeving suggereert.

Concluderend heeft het huidige onderzoek aangetoond dat de verspreiding van enteropathogenen geassocieerd met diarree in Porto Velho vergelijkbaar is met die waargenomen in noordoostelijke en oostelijke Amazonegebieden in de Staat Pará. Sommige bijzonderheden die in deze studie zijn waargenomen, wekken de belangstelling voor verder onderzoek naar enteropathogenen in het westelijke Amazonegebied met het oog op een betere identificatie van groepen, subgroepen en varianten van virale en bacteriële pathogenen die in de regio aanwezig zijn en informatie over antibioticaresistentie.

ACKNOWLEDGMENTS

Aan Dr Luiz Rachid Trabulsi, Instituto Butantã, voor zijn waardevolle commentaar en voor het lezen van het originele manuscript.

• Bern C, Martines J, Zousa I, Glass RI 1992. The magnitude of the global problem of diarrhoeal disease: a ten years update. Bull WHO 70: 705-714.

• Georges MC, Wachsmuth IK, Meunier DMV, Nebout N, Didier F, Siopathis MR, Gorges AJ 1984. Parasitic, bacterial and viral enteric pathogens associated with diarrhea in the Central African Republic. J Clin Microbiol 19: 571-575.

• Gomes T, Rassi V, Macdonald K, Ramos S, Trabulsi LR, Vieira M, Guth B, Candeias J, Ivey C, Toledo MR, Blake P 1991. Enteropathogenen geassocieerd met acute diarreeziekte bij stadskinderen in São Paulo, Brazilië. J Infect Dis 7: 164-331.

• Guerrant RL, Kirchhoff LV 1983. Prospectieve studie van diarreeziekten in Noordoost-Brazilië: ziektepatronen, voedingsimpact, etiologie en risicofactoren. J Infect Dis 7: 753-759.

• Leal N, Cavalcanti T, Hofer E 1988. Enteropathogenen gedecteerd bij gezonde kinderen in drie gemeenschappen met een laag inkomen in Recife, Pernambuco State, Brazilië. Mem Inst Oswaldo Cruz 83: 153-159.

• Linhares AC 1997. Rotavirus infectie in Brazilië: epidemiologie, immuniteit, en mogelijke vaccinatie. Braz J Infect Dis 1: 284-293.

• Munhoz OH, Coelho-Ramirez P, Serafin FA, Olarte J, Pickering LK, Du Pont H, Gutierrez G 1979. Gastroenteritis infecciosa aguda. Etiologia y su correlacion con las manifestaciones clínicas y el moco fecal. Arch Invest Med 10: 135-145.

• Plano Plurianual de Saúde, Rondônia 1996. Staatssecretariaat van Volksgezondheid van Rondônia, 168 blz.

• Riley LW, Ceballos BJO, Trabulsi LR, Toledo MRF, Blake PA 1984. The significance of hospitals as reservoirs for endemic multiresistant Salmonella typhimurium causing infection in urban Brazilian children. J Infect Dis 150: 236-241.

• Scragg JN, Rubidge CJ, Appelbaum PC 1978. Shigella infection in African and Indian children with special reference to Shigella septicemia. J Pediatr 93: 796-797.

• Stool BJ, Glass RJ, Huq MI, Khan MU, Bann H, Holt J 1982. Epidemiologic and clinical features of pacients infected with Shigella who attended a diarrheal disease hospital in Bangladesh. J Infect Dis 146: 177-183.

• Tornieporth NG, John J, Salgado K, Jesus P, Latham E, Melo MCN, Gunzburg ST, Riley LW 1995. Differentiatie van pathogene Escherichia coli-stammen bij Braziliaanse kinderen door PCR. J Clinical Microbiol 33: 1371-1374.

• Trabulsi LR, Toledo MRF, Ceballos BSO, Candeias JAN 1985a. Epidemiologie van diarreeziekten in Zuid-Amerika. Elsevier Science Publisher 12: 121-125.

• Trabulsi LR, Toledo, MRF, Murahovschi J, Neto UF, Candeias JAN 1985b. Epidemiologie van infantiele bacteriële diarree in Brazilië. Bact Diar Dis 20: 25-36.

Figuur | Tabel I | Tabel II | Tabel III