Diagnosis of Legionella Infection

Abstract

Legionella’s, die belangrijke oorzaken zijn van longontsteking bij de mens, worden nog steeds ten onrechte bestempeld als exotische ziekteverwekkers. Het vermogen om Legionella-infectie te diagnosticeren wordt beperkt door de aspecifieke aard van klinische kenmerken en de tekortkomingen van diagnostische tests. Ondanks recente verbeteringen zijn de bestaande diagnostische tests voor legionella-infectie niet gevoelig genoeg om alle klinisch belangrijke legionella’s op te sporen of zijn ze niet in staat om binnen een klinisch bruikbaar tijdsbestek resultaten te verschaffen. Inzicht in de lokale epidemiologie van legionella is belangrijk voor het nemen van beslissingen over de vraag of op legionella-infectie moet worden getest en welke diagnostische tests moeten worden gebruikt. In de meeste situaties is het gebruik van zowel de urineantigeentest als een sputumkweek de beste diagnostische combinatie. Polymerasekettingreactie (PCR) is een veelbelovend instrument, maar er zijn geen gestandaardiseerde tests in de handel verkrijgbaar. Verdere werkzaamheden moeten worden gericht op de ontwikkeling van urineantigeentests waarmee een breder scala van pathogene legionella’s kan worden opgespoord en op de ontwikkeling van gestandaardiseerde PCR-tests.

De ziekte van Legionella heeft nog steeds de reputatie een exotische infectie te zijn. Integendeel, wanneer systematisch wordt gezocht, worden Legionella-soorten consequent erkend als een van de veel voorkomende oorzaken van longontsteking. Buiten de onderzoekssetting zijn bevestigde diagnoses van legionellose echter zeldzaam. Het niet diagnosticeren van de veteranenziekte in de routine praktijk is grotendeels het resultaat van 3 factoren: het onvermogen om de veteranenziekte klinisch en radiografisch te onderscheiden van andere oorzaken van pneumonie, het niet bestellen van diagnostische tests voor Legionella infectie, en de tekortkomingen van beschikbare diagnostische tests. De ziekte van Legionnaires kan beter worden omschreven als een ongrijpbare diagnose dan als een exotische infectie.

Hoewel de diagnostische methoden zijn verbeterd gedurende de 25 jaar sinds Legionella pneumophila voor het eerst werd beschreven, is geen enkele momenteel beschikbare test in staat om de diagnose legionnaires tijdig te stellen met een hoge mate van sensitiviteit en specificiteit. Sommige auteurs hebben inderdaad het routinematig bestellen van microbiologische tests voor patiënten met pneumonie betwist, gesteund door gegevens die suggereren dat dergelijke tests geen significante invloed hebben op de keuze van antibioticatherapie en het resultaat voor de patiënt. Onlangs heeft Marrie betoogd dat deze benadering van de diagnose van legionellose verkeerd is. Het niet testen op Legionella-infectie kan de herkenning van uitbraken van legionella vertragen, kan veranderingen in de epidemiologie van de ziekte (waaronder de ontwikkeling van antimicrobiële resistentie) missen, en kan verhinderen dat personen schadevergoeding eisen voor beroepsmatig opgelopen infectie. Van belang is dat het mogelijk is om een subset van patiënten te selecteren voor wie de opbrengst van diagnostische tests voor legionella-infectie hoog is en die baat zouden hebben bij een specifieke diagnose.

Dit overzicht richt zich op de huidige diagnostische tests voor legionella-infectie, met een bijzondere nadruk op de tests die een diagnose stellen binnen een tijdsbestek dat van invloed is op het initiële infectiebeheer. Bij het bespreken van de verschillende diagnostische tests voor Legionella-infectie is het belangrijk om verschillende factoren in gedachten te houden. Ten eerste zijn er gespecialiseerde tests nodig om een legionella-infectie te diagnosticeren, en deze moeten specifiek door de arts worden aangevraagd. Ten tweede is het belangrijk om het onderscheid te zien tussen de prestaties van een test in een onderzoekslaboratorium en wat realistisch kan worden bereikt in een lokaal diagnostisch laboratorium. Er is een aanzienlijke interlaboratoriumvariatie gedocumenteerd voor het vermogen om legionella te kweken, en dit zal waarschijnlijk ook voor andere tests gelden. Ten derde wordt de interpretatie van de prestaties van diagnostische tests gehinderd door het ontbreken van een geschikte “gouden standaard”. Berekende sensitiviteits- en specificiteitsgegevens zullen variëren met verschillende vergelijkingsnormen. Ten vierde wordt de bruikbaarheid van diagnostische tests beïnvloed door de plaatselijke epidemiologie van legionella. L. pneumophila serogroep 1 is de belangrijkste oorzaak van legionellose in veel, zo niet de meeste gebieden in de wereld, en infectie met dit organisme is gemakkelijker te diagnosticeren dan infectie met andere Legionella-soorten en -serogroepen. In sommige regio’s zijn andere soorten en serogroepen belangrijker. Zo is Legionella longbeachae een belangrijke oorzaak van legionellose in Australië en Nieuw-Zeeland, waar de ziekte vaak in verband wordt gebracht met blootstelling aan potgrond. Infectie met deze soort zal niet worden gedetecteerd door de huidige urine-antigeentests en zal worden gemist door laboratoria die serologische tests alleen voor L. pneumophila uitvoeren.

Cultuur

Cultuurdiagnose vereist speciale media, adequate verwerking van specimens, en technische expertise (tabel 1). Er zijn verscheidene dagen nodig om een positief resultaat te verkrijgen, waarbij de meeste Legionella-kolonies binnen 3-5 dagen worden opgespoord. Het standaardmedium dat wordt gebruikt om legionella’s te kweken is gebufferde houtskoolgistextract-agar (BCYE), aangevuld met α-ketoglutaraat, met of zonder antimicrobiële stoffen. Dit medium levert ijzer en L-cysteïne, die beide essentieel zijn voor de groei van legionellae. De groei van sommige Legionella-soorten (bv. Legionella micdadei en Legionella bozemanii) wordt bevorderd door BCYE-agar aan te vullen met boviene serumalbumine, en toevoeging van indicatorkleurstoffen aan de media kan de identificatie vergemakkelijken. Kweekmedia die cefamandole bevatten, remmen de groei van Legionella-soorten die geen β-lactamase produceren, zoals L. micdadei en L. bozemanii.

Legionellae kan uit verschillende soorten monsters worden geïsoleerd, hoewel afscheidingen van de lagere luchtwegen (bijv, sputum en bronchoscopiemonsters) de meest gekozen monsters zijn. De belangrijkste beperking van sputumkweek is dat minder dan de helft van de patiënten met legionnaires sputum produceert. Andere factoren beïnvloeden de gevoeligheid van een kweek zodra een sputummonster is verkregen. Legionellabacteriën kunnen slecht overleven in respiratoire afscheidingen, en deze monsters moeten onmiddellijk worden verwerkt. Sommige patiënten met de veteranenziekte produceren sputum met relatief weinig purulentie; deze monsters kunnen worden afgewezen door laboratoria die sputummonsters met weinig polymorfonucleaire leukocyten afwijzen. Bijgevolg mogen geen afwijzingscriteria worden toegepast op sputummonsters die voor legionellacultuur worden ingestuurd. De ervaring van het laboratoriumpersoneel is ook belangrijk, en laboratoria met ervaring in Legionella cultuur hebben meer kans om het organisme te recupereren.

Geschatte gevoeligheden van sputumkweek variëren van <10% tot ∼80% en variëren afhankelijk van verschillende vergelijkingsnormen en door individuele laboratoria . In de praktijk zullen de betere resultaten waarschijnlijk alleen worden bereikt door laboratoria met speciale belangstelling voor legionella-infectie, en de gevoeligheden zijn meestal <50% wanneer serologische bevindingen als norm worden gebruikt. Bronchoscopische monsters zullen waarschijnlijk een grotere diagnostische opbrengst opleveren dan expectorische sputummonsters.

Legionellasoorten kunnen uit bloedkweken worden geïsoleerd, maar de opbrengst is gering. De groei van legionella’s wordt in stand gehouden door routinematige bloedkweekmedia, maar het is mogelijk dat het alarm van commerciële bloedkweekmachines niet wordt geactiveerd. Bijgevolg zijn blinde subculturen op vaste media vereist. Over het geheel genomen is de opbrengst van bloedkweken laag en waarschijnlijk niet van invloed op het klinisch management.

Direct Fluorescent Antibody (Dfa) Staining

DFA-kleuring kan legionella’s detecteren in respiratoire afscheidingen en weefselmonsters. Deze techniek heeft het voordeel dat zij binnen 2-4 uur resultaat oplevert, maar zij is technisch veeleisend en moet door ervaren laboratoriumpersoneel worden uitgevoerd. De gerapporteerde gevoeligheden van DFA-kleuring variëren, zijn consistent lager dan die van kweek, en zijn minder precies bekend voor andere soorten dan L. pneumophila. Voor afscheidingen van de lagere luchtwegen ligt de gevoeligheid in het algemeen tussen 25% en 66%, waarbij bronchoalveolaire lavagevloeistofmonsters een hogere opbrengst hebben dan transtracheale of sputummonsters. De specificiteit van DFA-kleuring is geschat op ∼94% , hoewel de test waarschijnlijk minder specifiek is in onervaren handen. Vals-positieve resultaten kunnen optreden als gevolg van kruisreacties met andere bacteriën, waaronder Bacteroides fragilis, Pseudomonas-soorten, Stenotrophomonas-soorten, en Flavobacterium-soorten. Kruisreacties kunnen een minder groot probleem vormen wanneer monoklonale antilichamen voor DFA worden gebruikt. Problemen met gevoeligheid en specificiteit hebben het gebruik van DFA-kleuring beperkt, en een positief DFA-resultaat bij afwezigheid van ander ondersteunend bewijs wordt nu algemeen niet aanvaard als voldoende voor de diagnose van Legionella-infectie.

Urinaire Antigeendetectie

Detectie van oplosbaar Legionella-antigeen in urinespecimens is een snelle methode die een vroege diagnose van Legionella-infectie oplevert en een nuttig hulpmiddel is geweest voor het onderzoek van uitbraken van legionairsziekte . Er zijn al verscheidene jaren commerciële kits verkrijgbaar die gebruik maken van zowel RIA- als EIA-methoden en vergelijkbare prestatiekenmerken hebben. Onlangs is een immunochromatografische test (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax) ontwikkeld die een vergelijkbare gevoeligheid en specificiteit heeft als EIA . Deze test is gemakkelijk uit te voeren en kan binnen 15 minuten een resultaat opleveren.

Voor de detectie van L. pneumophila serogroep 1 hebben urine-antigeentests een gevoeligheid van 70%-100% en een specificiteit van bijna 100% . De gevoeligheid kan met wel 20% worden verhoogd door 25-voudige concentratie van urinemonsters vóór de test. Het grootste nadeel van deze tests is dat ze niet betrouwbaar andere organismen dan L. pneumophila serogroep 1 kunnen opsporen. Er zijn breedspectrumtests ontwikkeld waarmee oplosbare antigenen van een groot aantal Legionella-soorten kunnen worden opgespoord, maar die zijn niet in de handel verkrijgbaar. De Biotest Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) is bedoeld om andere legionella’s dan L. pneumophila serogroep 1 op te sporen, maar doet dit minder betrouwbaar dan het opsporen van L. pneumophila serogroep 1 . Valse-positieve urine-antigeenresultaten zijn voorgekomen bij patiënten met serumziekte.

Legionella-antigenurie kan al 1 dag na het begin van de symptomen worden opgespoord en houdt dagen tot weken aan. In één geval werd gedocumenteerd dat uitscheiding van antigeen gedurende >300 dagen optrad. Oplosbare Legionella-antigenen zijn ook gedetecteerd in andere monsters dan urine, waaronder monsters van sputum, longweefsel, serum en pleuravocht, hoewel het gebruik van dergelijke monsters nog niet volledig is geëvalueerd.

Urinaire antigeentests zijn nu een gevestigd en waardevol hulpmiddel voor de diagnose van legionairsziekte, met name in regio’s waar L. pneumophila serogroep 1 de meest voorkomende oorzaak van de ziekte is. Op plaatsen waar slechts een minderheid van de infecties door L. pneumophila serogroep 1 wordt veroorzaakt, dragen de thans beschikbare urineantigeentests in mindere mate bij aan de bestaande laboratoriumtests.

Serologische tests

Serologische tests voor Legionella-infectie zijn een waardevol epidemiologisch hulpmiddel maar hebben weinig invloed op de klinische besluitvorming vanwege de tijd die verstrijkt voordat een resultaat beschikbaar is. De antilichamen die als reactie op infectie worden geproduceerd zijn over het algemeen een mengsel van IgA, IgM, en IgG, en tests moeten alle typen detecteren voor optimale gevoeligheid. De meting van specifiek IgM is een onbetrouwbare marker van acute infectie, omdat IgM-antilichamen gedurende lange perioden kunnen blijven bestaan. Seroconversie kan verscheidene weken duren, wat een belangrijke beperking van serologische tests is. In de meeste gevallen wordt binnen 3-4 weken een 4-voudige toename van de antilichaamtiter vastgesteld, maar in sommige gevallen kan dit >10 weken duren. Het te vroeg verkrijgen van serummonsters in de herstelfase resulteert ongetwijfeld in veel vals-negatieve resultaten en verklaart waarschijnlijk gedeeltelijk de 20-30% van de patiënten met legionellabesmetting die vermoedelijk geen aantoonbare antilichaamrespons ontwikkelen. Het is echter duidelijk dat een deel van de mensen met bewezen legionella-infectie geen aantoonbare seroconversie vertonen. In de praktijk moeten artsen worden aangemoedigd om serummonsters van de herstelfase te verkrijgen 3 weken na het begin van de ziekte voor tests parallel met serummonsters verkregen tijdens de acute fase. Als er na deze periode geen seroconversie optreedt en Legionella-infectie nog steeds wordt vermoed, moet een extra convalescentiestaal worden verkregen.

Van de verschillende beschikbare antilichaamdetectiemethoden is indirecte immunofluorescentie de standaardreferentietest. Een 4-voudige of grotere stijging van de reciproke antilichaamtiter tot ⩾128 wordt als diagnostisch beschouwd. Acute-fase reciproke antilichaamtiters van ⩾256 in aanwezigheid van pneumonie werden vroeger voldoende geacht voor een voorlopige diagnose, maar dit is onbetrouwbaar gebleken, vooral gezien de hoge prevalentie van positiviteit van Legionella-antilichamen bij sommige mensen zonder klinische aanwijzingen voor legionellose. Er is vrijwel geen rol voor het testen van afzonderlijke serummonsters.

Een ander nadeel van serologische tests is het onvermogen om alle Legionella-soorten en serogroepen nauwkeurig te detecteren. Hoewel seroconversie tegen L. pneumophila serogroep 1 over het algemeen als zeer voorspellend voor ziekte wordt beschouwd, is de gevoeligheid en specificiteit van seroconversie tegen andere soorten en serogroepen niet rigoureus bevestigd. Bovendien kan de vorming van kruisreactieve antilichamen tussen leden van de familie Legionellaceae het moeilijk maken om de infecterende soort of serogroep te bepalen. Sommige patiënten met een infectie die niet tot L. pneumophila serogroep 1 behoort, vertonen seroconversie naar L. pneumophila serogroep 1 . Omgekeerd duidt sequentie-gebaseerde identificatie van Legionella PCR-producten van patiënten met seroconversie naar andere Legionella-soorten dan L. pneumophila erop dat sommigen waarschijnlijk met L. pneumophila besmet waren (ongepubliceerde waarnemingen). Kruisreactieve antilichamen worden ook af en toe gevonden bij patiënten met infecties veroorzaakt door niet-Legionellabacteriën, waaronder pseudomonaden, mycobacteriën, Bacteroides-soorten, en Campylobacter-soorten. Een interessante kruisreactie treedt op tussen L. bozemanii en Rickettsia typhi als gevolg van een gedeeld antigeen.

Nucleïnezuuramplificatie

Nucleïnezuuramplificatie

De laatste tijd zijn DNA-detectietechnieken veelbelovend gebleken voor de snelle diagnose van Legionella-infectie. PCR maakt de specifieke amplificatie van minieme hoeveelheden Legionella-DNA mogelijk, levert in korte tijd resultaten op en kan infecties opsporen die door elke Legionella-soort en -serogroep worden veroorzaakt. Momenteel is Legionella PCR alleen beschikbaar in een beperkt aantal laboratoria die een verscheidenheid van interne assays gebruiken.

PCR is met succes gebruikt om Legionella-DNA in een reeks milieu- en klinische monsters op te sporen. Bij het testen van monsters van de onderste luchtwegen is herhaaldelijk aangetoond dat PCR een gevoeligheid heeft die gelijk is aan of groter is dan die van kweken. PCR zou dan ook kunnen worden beschouwd als de voorkeurstest voor patiënten die sputum produceren. De rol van PCR voor het testen van andere soorten monsters is minder duidelijk. Legionella-DNA kan worden opgespoord in urine, serum en leukocytenmonsters van patiënten met de veteranenziekte met gevoeligheden van 30%-86% . De gevoeligheid van PCR zal waarschijnlijk toenemen bij het testen van monsters die vroeg in het ziekteverloop zijn verkregen en bij het testen van >1 monstertype van elke patiënt . Keel swabs kunnen ook een geschikt monster zijn voor PCR testen, maar deze toepassing is slechts in een enkele studie geëvalueerd.

Verder werk is nodig om een standaard PCR methode vast te stellen die robuust genoeg zal zijn om buiten de setting van een onderzoekslaboratorium te worden gebruikt. Toepassing op niet-ademhalingsmonsters is bijzonder aantrekkelijk, omdat zo het probleem wordt omzeild van patiënten die geen sputummonsters produceren. De ontwikkeling van een optimale PCR-test is bemoeilijkt door de intermitterende besmetting van sommige commerciële DNA-extractiekits met Legionella-DNA . Het gebruik van deze kits voor het verwerken van monsters kan resulteren in vals-positieve resultaten en benadrukt het belang van het opnemen van geschikte controles in elke assay run.

Teststrategie

Omdat legionnaires disease klinisch of radiografisch niet kan worden onderscheiden van andere oorzaken van pneumonie, kan de beslissing om te testen op Legionella-infectie moeilijk zijn en wordt deze vaak grillig genomen. Het is belangrijk dat men op de hoogte is van de plaatselijke epidemiologie. Sommige laboratoria in gebieden waar legionellasoorten een veel voorkomende oorzaak van pneumonie zijn, hebben ervoor gekozen om routinematig alle sputummonsters van patiënten met pneumonie op Legionella-media te kweken. Er zijn echter maar weinig laboratoria die de extra kosten in verband met routinematige legionellakweken kunnen verantwoorden. Op de meeste plaatsen is de incidentie van Legionella-infectie onbekend en de beslissing om diagnostische tests voor Legionella-infectie te bestellen is gewoonlijk beperkt tot risicopatiënten, tot patiënten met ernstige pneumonie en tot uitbraakscenario’s. Het is zeker mogelijk om een subgroep van patiënten te selecteren bij wie de opbrengst van de diagnostische tests op legionella waarschijnlijk relatief hoog zal zijn. Deze groep omvat bejaarden, rokers, immunosuppressieve personen, personen met chronische longziekte, patiënten die verblijven in ziekenhuizen met door legionella gekoloniseerd water, en personen die zijn blootgesteld aan potgrond. De incidentie van de veteranenziekte is hoger bij patiënten met ernstige pneumonie, en alle patiënten met pneumonie die op een intensive care afdeling worden opgenomen, moeten op deze infectie worden getest.

Op plaatsen waar L. pneumophila serogroep 1 de overheersende oorzaak van Legionella-infectie is, of tijdens een uitbraak van infectie met L. pneumophila serogroep 1, is de urine-antigeentest een bijzonder waardevol diagnostisch hulpmiddel. De ontwikkeling van een commerciële urine-antigeentest die ook andere menselijke Legionellapathogenen op betrouwbare wijze detecteert, zou een belangrijke stap voorwaarts betekenen en zou deze test waarschijnlijk in bijna alle settings tot het diagnostische hulpmiddel bij uitstek maken. Op geografische locaties waar andere legionella’s dan L. pneumophila serogroep 1 numeriek belangrijke ziekteverwekkers zijn, zijn de huidige urineantigeentests nog steeds nuttig maar mogen zij niet als enig diagnostisch middel worden gebruikt. Indien beschikbaar, is Legionella PCR gecombineerd met urine-antigeentesten waarschijnlijk de beste initiële teststrategie die alle Legionella-soorten detecteert en resultaten oplevert binnen een tijdsbestek dat van invloed is op het klinisch management.

Wanneer PCR niet beschikbaar is, is de urine-antigeentest gecombineerd met kweek van monsters van de lagere luchtwegen de beste testcombinatie. Kweek blijft een belangrijk diagnostisch hulpmiddel, maar de relatief lage gevoeligheid en de afhankelijkheid van de beschikbaarheid van een monster van de onderste luchtwegen maken het ontoereikend als enige diagnostische test. Hoewel serologisch onderzoek geen invloed heeft op de initiële behandeling, kan het nuttig zijn als er tijdens de acute fase van de infectie geen specifieke diagnose wordt gesteld, maar zowel monsters uit de acute fase als monsters uit de herstelfase moeten parallel worden getest. Tijdens een vermoedelijke uitbraak van legionellose is een agressieve aanpak van de diagnose gerechtvaardigd, waarbij een combinatie van testmethoden wordt gebruikt.

Legionella-soorten kunnen soms Pontiac-koorts veroorzaken, een acute, febriele, niet-pneumonische ziekte die wordt gekenmerkt door een hoge aanvalskans, korte incubatieperiode en snel herstel. De diagnose van Pontiac-koorts berust gewoonlijk op de herkenning van typische klinische kenmerken tijdens een uitbraaksituatie, en de diagnose wordt bevestigd door serologisch onderzoek bij de getroffen personen. Het gebruik van kweek is grotendeels beperkt tot het testen van omgevingsmonsters om de bron van de uitbraak te bepalen, hoewel L. pneumophila serogroep 1 is geïsoleerd uit een tracheaal aspiraat van een kind met Pontiac-koorts.

Conclusies

Legionella-infectie wordt ongetwijfeld te weinig herkend. De diagnose berust op het gebruik van gespecialiseerde tests, vaak in combinatie. Urine-antigeentesten, sputumkweek en PCR-testen van monsters van de lagere luchtwegen zijn de belangrijkste diagnostische instrumenten voor de detectie van Legionella-infectie vroeg in het ziekteverloop. De ontwikkeling van urine-antigeentests die een breder scala van pathogene legionella’s detecteren en de ontwikkeling van gestandaardiseerde PCR-tests zullen belangrijke vorderingen in de Legionella-diagnostiek zijn. De toegenomen beschikbaarheid en het gebruik van verbeterde diagnostische tests zal helpen om de epidemiologie van legionairsziekte beter te karakteriseren, met inbegrip van de werkelijke incidentie en geografische variatie.

Acknowledgments

Ik ben Steve Chambers dankbaar voor nuttig commentaar op het artikel in het manuscript.