Aëroob en anaëroob metabolisme bij vissen met een zuurstofminimum: the role of alcohol dehydrogenase | Journal of Experimental Biology

DISCUSSION

De lantaarnvissoorten uit de Arabische Zee en hun confamilialen uit de Californische Stroom, de Golf van Mexico en Antarctica zijn sterke verticale migratoren, die zich verplaatsen van middenwaterdiepten (200-1000 m), waar ze overdag verblijven, naar ’s nachts dicht bij het wateroppervlak, waar ze zich voeden, meestal met zoöplankton (Pearcy et al., 1977; Gjøsaeter, 1984; Torres en Somero, 1988a; Lancraft et al., 1989; Hopkins en Gartner, 1992; Luo et al., 2000). Verticale migratie is een foerageerstrategie die gebruikt wordt door lantaarnvissen over de hele wereld (Robinson et al., 2010), waardoor de vier regio’s van de huidige studie natuurlijke experimentele systemen werden die sterk verschilden in hun opgeloste zuurstof- en temperatuurprofielen, maar zeer weinig in de dagelijkse gewoonten van hun gemeenschappelijke soorten. De proefpersonen voor alle vier de regio’s waren dus ecologische analogen. Fysiologische reacties op twee belangrijke fysische variabelen, zuurstof en temperatuur, waren in het spel.

In de Arabische Zee en de Golf van Mexico was zuurstof duidelijk de fysische variabele met de meeste invloed. De temperatuurprofielen in de twee systemen waren vrijwel identiek (Fig. 1) maar de zuurstofprofielen verschilden radicaal. In het systeem van de Arabische Zee verdween de zuurstof op een diepte van 200 m en bleef op nul tot een diepte van 1000 m, terwijl in de Golf van Mexico de zuurstof over hetzelfde bereik daalde tot ongeveer de helft van de oppervlaktewaarde (luchtverzadiging) (Fig. 1). In beide systemen verbleven de vissen overdag in het zuurstofminimum. In de Arabische Zee zouden de myctophiden echter tot anaërobiose beperkt zijn geweest, maar in de Golf van Mexico lagen de zuurstofconcentraties ruim binnen het normoxische bereik van de myctophiden (Donnelly en Torres, 1988). De biochemische strategieën van de soorten om met hun respectieve zuurstofprofielen om te gaan, worden weerspiegeld in hun enzymatische activiteiten. LDH, het eindenzym in de glycolytische route tijdens anaërobiose, is ongeveer driemaal hoger bij vissen uit de Arabische Zee dan bij die uit de Golf van Mexico, hetgeen wijst op een sterk anaërobisch vermogen (Fig. 2). De veel hogere activiteit van CS in de vissen uit de Golf van Mexico wijst daarentegen op een sterk aërobe strategie, mogelijk gemaakt door het milde zuurstofminimum dat in de Golf van Mexico wordt aangetroffen. De ADH-activiteit in de vissen uit de Arabische Zee was ook ongeveer driemaal zo hoog als die in de vissen uit de Golf van Mexico, wat de vissen de biochemische machinerie geeft om lactaat, dat niet via de kieuwen kan worden uitgescheiden, om te zetten in ethanol, dat wel kan worden uitgescheiden (Shoubridge en Hochachka, 1980; Vornanen et al., 2009).

Het huidige model voor de omzetting van lactaat naar ethanol in goudvissen en karpers (bv. Shoubridge en Hochachka, 1980; Vornanen et al., 2009) vereist eerst dat lactaat wordt geoxideerd tot pyruvaat in de aanwezigheid van NADH, een thermodynamische stap bergop (ΔG′°=+25,1 kJ mol-1) (Lehninger, 1970). Pyruvaat wordt vervolgens omgezet in acetaldehyde in het mitochondrion door het pyruvaat dehydrogenase complex, waarbij CO2 vrijkomt. Acetaldehyde wordt vervolgens gereduceerd tot ethanol door ADH in aanwezigheid van NADH (Fig. 4). De biochemische machinerie voor de vorming van ethanol bevindt zich uitsluitend in de zwemspier, die niet alleen het lactaat verwerkt dat in de spier wordt gegenereerd, maar ook het lactaat dat door andere weefsels, zoals de hersenen, de lever en het hart, wordt geproduceerd en via de bloedbaan aan de spier wordt geleverd (Shoubridge en Hochachka, 1980; Vornanen et al., 2009) (Fig. 4). De activiteit van ADH, gevonden in de spieren van de vissen in de Arabische Zee, suggereert een soortgelijke strategie.

De skeletspieren van vissen spelen een belangrijke rol in de verwerking van lactaat na de inspanning via de gluconeogene en glycogene routes, een situatie die sterk verschilt van die bij zoogdieren, waar de enzymatische machinerie voor de regeneratie van glucose voornamelijk in de lever wordt gevonden (Suarez et al., 1986; Moon, 1988; Gleeson, 1996). De spieren van vissen zijn dus multifunctioneler dan die van zoogdieren en bezitten een groter aantal enzymen en een grotere inherente metabolische flexibiliteit dan de spieren van zoogdieren, met inbegrip van een groter potentieel voor biosynthese (Gleeson, 1996). Er is zelfs aangetoond dat de skeletspieren van vissen na de inspanning lactaat vasthouden (Gleeson, 1996), waardoor de regeneratie van glucose in de spier wordt vergemakkelijkt en het herstel na de inspanning wordt verbeterd. In het geval van de goudvis, de kroeskarper en nu de lantaarnvis, maakt de metabolische flexibiliteit van de spierenzymen nieuwe biochemische oplossingen mogelijk voor het probleem van anaërobiose.

MDH activiteit was ook significant hoger in de Arabische Zee vissen dan in die uit de Golf van Mexico, maar de meervoudige rollen van MDH in de cel maken de verklaring voor dit aanzienlijk minder eenvoudig. Spierweefsel werd gehomogeniseerd met homogenisatoren van geslepen glas, waardoor zowel cytosolisch als mitochondriaal MDH in de testcocktail actief zou kunnen zijn. De in tabel 1 vermelde activiteiten waren derhalve een combinatie van MDH-activiteit uit de twee celcompartimenten. Bij het aërobe metabolisme is MDH duidelijk belangrijk als het enzym dat de vorming van oxaloacetaat in de Krebs-cyclus katalyseert. Bovendien werken cytosolisch en mitochondriaal MDH onder aërobe omstandigheden samen om de door de glycolyse geproduceerde reductie-equivalenten naar het mitochondrium te transporteren voor verwerking in het elektronentransportsysteem, wat noodzakelijk is vanwege de ondoordringbaarheid van het mitochondriale membraan voor cytosolisch NADH. Een derde rol van MDH is de katalyse van een belangrijke stap in de conventionele gluconeogene route. In visspieren wordt namelijk aangenomen dat de gluconeogenese verloopt via een vrijwel directe omkering van de glycolyse (Suarez et al., 1986; Moon, 1988; Gleeson, 1996) en MDH is geen belangrijke deelnemer.

Wat het meest waarschijnlijk is, is dat MDH helpt bij de handhaving van het redoxevenwicht in de cel tijdens perioden van overgang van normoxische naar anoxische omstandigheden wanneer de vissen overdag naar beneden trekken naar het zuurstofminimum en opnieuw wanneer de vissen ’s nachts naar boven trekken naar de hogere zuurstof van het oppervlaktewater. De malaat-shuttle kan NADH in of uit het mitochondrium verplaatsen, afhankelijk van de cellulaire behoefte aan reducerend vermogen.

Lantaarnvissoorten van het grensgebied van Californië en Antarctica vertoonden soortgelijke tendensen als hun confamilialen van de Arabische Zee en de Golf van Mexico, met dien verstande dat zowel temperatuur als zuurstof de resultaten beïnvloedden. Electrona antarctica, de sterkste en actiefste verticale migrant onder de Antarctische soorten, vertoonde ook de hoogste LDH-activiteit, waardoor de Antarctische soorten als geheel een significant hogere waarde vertoonden dan die uit Californië bij dezelfde bemonsteringstemperatuur. De invloed van temperatuuradaptatie bij een robuust actieve vis (Torres en Somero, 1988b; Yang en Somero, 1993; Vetter en Lynn, 1997) is de meest waarschijnlijke verklaring voor de hoge waarde. Als de LDH-activiteit van Electrona wordt beschouwd bij de omgevingstemperatuur van 0°C, of de helft van de waarde in tabel 1 (54 U g-1 nat gewicht), ligt zij precies in het middengebied van de waarden voor de Californische soorten bij 10°C, hetgeen de opwaartse invloed van temperatuuradaptatie op de LDH-activiteit bij Electrona onderstreept. Noch de CS-, noch de MDH-activiteit vertoonde significante verschillen tussen de Californische en de Antarctische soorten bij de beproevingstemperatuur van 10°C, hoewel de gemiddelde waarden voor de Californische soorten in beide gevallen hoger waren.

ADH-activiteit was significant hoger bij de Californische soorten, ondanks de invloed van de beproevingstemperatuur, die, net als bij LDH, de Antarctische waarden naar boven toe scheef zou hebben getrokken. Bij ADH was de meest waarschijnlijke invloed op de totale enzymactiviteit het Californische zuurstofminimum, dat in de kern (700 m; Fig. 1) een waarde van 0,2 ml l-1 vertoont. Verticale migraties van Californische lantaarnvissen zouden hen overdag brengen bij zuurstofwaarden tussen 0,5 en 1,0 ml l-1 (16-32 Torr, ∼2,1-4,2 kPa), ver beneden hun vermogen om efficiënt zuurstof te onttrekken (cf. Torres et al, 1979; Donnelly and Torres, 1988).

Lantaarnvissen uit de Arabische Zee en het grensgebied van Californië worden overdag geconfronteerd met een zuurstofconcentratie van nul tot bijna nul, na een zwemtocht van minstens 5000 lichaamslengten tijdens hun neerwaartse excursie (uitgaande van een minimumzwemtocht van 300 m en een lichaamslengte van ongeveer 5 cm; Tabel 1). Hun energetisch meest efficiënte toevlucht zou erin bestaan de zwemactiviteit binnen het zuurstofminimum zo laag mogelijk te houden om de behoefte aan anaërobiose tot een minimum te beperken. De meeste facultatief anaërobe organismen (b.v. tweekleppigen) (Hochachka, 1980; Hochachka en Somero, 2002) vertonen een duidelijke activiteitsdaling tijdens anaërobiose ten gevolge van de hoge energiekost van zelfs de meest efficiënte anaërobe routes. Minimale activiteit minimaliseert het gebruik van opgeslagen energie. In combinatie met het gebruik van de ADH-route zou de accumulatie van eindproducten ook worden geminimaliseerd door de uitscheiding van ethanol via de kieuwen, terwijl het redox-evenwicht in de spiercellen wordt gehandhaafd. De excursie naar boven in de schemering naar normoxisch water kan dan worden ingezet met een relatief schone ‘metabolische lei’ waarbij de malaat shuttle helpt bij de overgang zoals hierboven beschreven.

Diel verticale migratie is een aanpassing die wordt vertoond door vele soorten zoöplankton en micronekton naast de lantaarnvissen (Hopkins et al., 1994; Hopkins et al., 1996; Robinson et al., 2010), vermoedelijk om visuele predatie te minimaliseren. Omdat het gezichtsvermogen en de kans op aanvallen door visuele predatoren overdag veel groter zijn, komen veel dieren alleen ’s nachts in de voedselrijke oppervlaktewateren en migreren ze bij zonsopgang naar de donkere dieptes. Soorten die in zuurstofminima verblijven of daar naartoe migreren, hebben te maken met een stabiele fysische eigenschap (Stramma et al., 2008) die kan worden aangepakt door fysiologische en biochemische aanpassing. In het geval van de in dit werk bestudeerde lantaarnvissen biedt het zuurstofminimum een refugium tegen pelagische roofdieren die in de zuurstofminima van de Arabische Zee of de Californische grens net zo moeilijk zouden kunnen jagen als in de dode zones van de kustoceaan.

Middenwatervissen van de open oceaan verschillen aanzienlijk van kust- en zoetwatervissen wat betreft het tijdstip en de aard van hun blootstelling aan weinig of geen zuurstof. De best bestudeerde visachtige anaerobe, de kroeskarper, ondergaat een voorspelbaar verblijf zonder zuurstof gedurende de wintermaanden in zijn natuurlijke habitat in Centraal-Azië en Europa (Vornanen en Paajanen, 2004). De individuen die in kleine eutrofe vijvers leven, overwinteren onder een ijs- en sneeuwlaag die de atmosferische uitwisseling verhindert, wat resulteert in perioden van anoxie die 90 dagen of meer kunnen duren (Piironen en Holopainen, 1986). Het feit dat blootstelling aan anoxie een seizoensgebonden gebeurtenis is, maakt het mogelijk dat metabolische en morfologische aanpassingen plaatsvinden voordat de daling van de omgevingszuurstof zich heeft voorgedaan. De metabolische aanpassing omvat de accumulatie van glycogeen in lever, spieren, hersenen en hart om de behoefte aan anaërobe activiteit aan te vullen. Morfologische aanpassingen omvatten een toename van het aantal kieuwlamellen, resulterend in een 7-voudige toename van het kieuwoppervlak (Vornanen et al., 2009) om de zuurstofuitwisseling te vergemakkelijken. Misschien wel het meest verbazingwekkend is het feit dat hart en hersenen van kroeskarpers volledig functioneel blijven tijdens anoxie, een strategie die uniek is onder de gewervelde dieren, waardoor het ethanol dat uit spierweefsels wordt gespoeld, kan worden afgegeven voor uitscheiding via de kieuwen, en de distributie van glucose vanuit levervoorraden naar plaatsen waar het nodig is (Vornanen et al., 2009).

Kustvissen komen hypoxie tegen in een verscheidenheid van natuurlijke en antropogeen beïnvloede situaties. Getijdenpoelen of geulen in gebieden met rottende vegetatie, zoals in mangrovebossen, of in intergetijdengebieden met organisch rijk slib, kunnen bij eb zuurstofloos worden, waardoor inheemse soorten soms worden blootgesteld aan sulfide (Bagarinao en Vetter, 1989; Graham, 1997; Geiger et al., 2000). Bij de vissen die daartoe zijn uitgerust, is luchtademhaling een haalbare optie om de effecten van anoxie en blootstelling aan sulfide te minimaliseren (Graham, 1997; Geiger et al., 2000). Anderen maken gebruik van de biochemische optie van mitochondriale oxidatie van het sulfide om de toxische effecten ervan te minimaliseren, vergelijkbaar met soorten bij de hydrothermale bronnen (Bagarinao en Vetter, 1989). In de meeste natuurlijk voorkomende hypoxische systemen zijn zuurstofloze excursies episodisch, zoals in mangrove getijdenpoelen, of treden ze regelmatig op bij eb gedurende de warmere maanden van het jaar. Deze situaties zijn voorspelbaar en komen vaak genoeg voor om te kunnen worden opgevangen door fysiologische aanpassing. Soorten die leven in omgevingen met natuurlijke hypoxie zijn fysiologisch voorbereid om ermee om te gaan.

Anthropogeen geïnduceerde of versterkte hypoxische gebeurtenissen, of dode zones, doen zich met grotere regelmaat voor in de kustoceanen en -baaien van Noord-Amerika, Europa en Azië (Diaz en Rosenberg, 2008). Dode zones worden meestal in verband gebracht met de afspoeling van voedingsstoffen en zomerstratificatie in ondiepe mariene systemen (Diaz en Breitburg, 2009; Rabalais et al., 2002). De belasting met nutriënten versnelt de productie en de afbraak van atmosferische zuurstof wordt geremd door de stratificatie van de waterkolom. Onder de gemengde laag zorgt microbiële afbraak van zinkend organisch materiaal voor een ernstige zuurstofdepletie, waarbij in sommige gevallen alle zuurstof uit de bodem en de habitat op geringe diepte wordt verwijderd (Diaz en Breitburg, 2009). De overleving van vissen in hypoxische zones wordt bepaald door de doeltreffendheid van de soorten bij het verwijderen van zuurstof bij verlaagde PO2 (Chapman en McKenzie, 2009; Perry et al., 2009; Richards, 2009), die sterk varieert naargelang de taxa (Richards, 2009). In geen enkel geval wordt langdurige anaërobiose door vissen gebruikt als een strategie om met dode zones om te gaan.

Als er kleine maar constante hoeveelheden zuurstof in het water zijn, zoals in een zuurstofminimumzone, hebben dieren mechanismen ontwikkeld om die zuurstof te onttrekken en te gebruiken. Drie mechanismen zijn een groter kieuwoppervlak, een efficiënt bloedcirculatiesysteem en een bloedpigment met hoge affiniteit. Grote kieuwoppervlakken zijn gemeten bij vissen die leven in de zuurstofminimumlaag van de Californische stroming (Ebeling en Weed, 1963; Gibbs en Hurwitz, 1967). Gnathophausia ingens, een lophogastrid schaaldier dat in dit gebied leeft, heeft niet alleen sterk ontwikkelde kieuwen en een efficiënte bloedsomloop (Childress, 1971; Belman and Childress, 1976), maar ook een hemocyanine met een hoge affiniteit, een groot positief Bohr-effect en een hoge coöperativiteit. Het is in staat zuurstof te laden bij een partiële druk van 6 Torr (∼0,8 kPa); zijn hoge coöperativiteit stelt het pigment in staat zuurstof te lossen in de weefsels over een zeer kleine diffusiegradiënt (Sanders en Childress, 1990).

De lantaarnvissen vormen een speciose, pan-globale pelagische vissengroep, waarvan de grote meerderheid verticale migranten zijn (Nelson, 2006; Smith en Heemstra, 1991). Hun geografische verspreiding omvat alle ernstige zuurstofminima in de oceanen, waarvan er twee in de huidige studie zijn behandeld. Wij stellen voor dat zij, in plaats van gebruik te maken van de strategie van de soorten die permanent binnen de strengste delen van de zuurstofminimumlaag blijven, wat een aanzienlijke fysiologische en morfologische investering vergt (Childress en Seibel, 1998), in staat zijn de ADH-route te gebruiken om de accumulatie van eindproducten te minimaliseren en tegelijkertijd een deel van de dag anaërobiose te gebruiken om aan de eisen van het zuurstofminimum te voldoen. De anaërobe strategie doet denken aan die welke wordt gebruikt door intergetijden soorten tijdens laagtij (cf. Hochachka, 1980; Torres et al., 1977), maar met het voordeel van een meer voorspelbare en controleerbare intrede in een zuurstofarme omgeving. Dit is het eerste verslag van ADH activiteit in de spieren van andere vissen dan de goudvis en de karper, een grotendeels onopgemerkte anaërobe strategie die wellicht wijdverbreider is.