Diagnóstico da Infecção por Legionella

Abstract

Legionellae, que são importantes causas de pneumonia em humanos, continuam a ser incorrectamente rotuladas como patogénicos exóticos. A capacidade de diagnosticar a infecção por Legionella é limitada pela natureza inespecífica das características clínicas e pelas deficiências dos testes de diagnóstico. Apesar das melhorias recentes, os testes diagnósticos existentes para a infecção por Legionella não têm sensibilidade para detectar todas as legionelas clinicamente importantes ou são incapazes de fornecer resultados dentro de um período de tempo clinicamente útil. A compreensão da epidemiologia local da Legionella é importante para a tomada de decisões sobre se se deve testar a infecção pela Legionella e quais os testes diagnósticos a utilizar. Na maioria das situações, o uso do teste do antígeno urinário mais a cultura da expectoração é a melhor combinação diagnóstica. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta promissora, mas os ensaios padronizados não estão disponíveis comercialmente. Outros trabalhos precisam focar no desenvolvimento de testes de antígenos urinários que detectam uma gama mais ampla de legionelas patogênicas e no desenvolvimento de testes PCR padronizados.

Doença dos legionários continua a ter a reputação de ser uma infecção exótica. Pelo contrário, quando procuradas sistematicamente, as espécies de Legionella são consistentemente reconhecidas como uma das causas comuns de pneumonia. Fora do cenário da pesquisa, porém, diagnósticos confirmados de legionelose são pouco freqüentes. Esta falha no diagnóstico da doença do legionário na prática de rotina é em grande parte o resultado de 3 factores: a incapacidade de distinguir clinicamente e radiograficamente a doença do legionário de outras causas de pneumonia, a não encomenda de testes diagnósticos para a infecção por Legionella, e as deficiências dos testes diagnósticos disponíveis. A doença do legionário é descrita com mais precisão como um diagnóstico elusivo do que como uma infecção exótica.

Embora os métodos diagnósticos tenham melhorado durante os 25 anos desde que a Legionella pneumophila foi descrita pela primeira vez, nenhum teste disponível atualmente é capaz de diagnosticar a doença do legionário de forma oportuna, com um alto grau de sensibilidade e especificidade. De facto, alguns autores desafiaram a encomenda de rotina de quaisquer testes microbiológicos para doentes com pneumonia, apoiados por dados que sugerem que tais testes não influenciam significativamente a escolha da terapia antibiótica e o resultado do doente. Recentemente, Marrie argumentou que esta abordagem ao diagnóstico da doença do legionário estava errada. A incapacidade de testar a infecção por Legionella pode atrasar o reconhecimento de surtos de doença do legionário, pode falhar alterações na epidemiologia da doença (incluindo o desenvolvimento de resistência antimicrobiana), e pode impedir que as pessoas reclamem uma compensação por infecção adquirida profissionalmente. De importância, é possível seleccionar um subconjunto de doentes para os quais o rendimento dos testes de diagnóstico da infecção por Legionella é elevado e que beneficiariam de um diagnóstico específico.

Esta revisão centra-se nos testes de diagnóstico actuais da infecção por Legionella, com particular ênfase nos testes que fornecem um diagnóstico num período de tempo que irá afectar a gestão inicial da infecção. Ao rever os vários testes de diagnóstico para a infecção pela Legionella, é importante ter em mente vários factores. Primeiro, são necessários testes especializados para diagnosticar a infecção pela Legionella, e estes devem ser especificamente solicitados pelo médico. Segundo, é importante apreciar a distinção entre a realização de um teste em um laboratório de pesquisa com o que pode ser realisticamente alcançado em um laboratório de diagnóstico local. Uma considerável variação interlaboratorial tem sido documentada para a capacidade de cultura de legionellae , e isto também é provável que se estenda a outros testes. Terceiro, a interpretação do desempenho dos testes de diagnóstico é dificultada pela falta de um “padrão de ouro” adequado. Os dados calculados de sensibilidade e especificidade irão variar com diferentes padrões de comparação. Quarto, a utilidade dos testes diagnósticos é influenciada pela epidemiologia local da Legionella. L. pneumophila serogrupo 1 é a causa predominante da legionelose em muitas, se não a maioria, áreas do mundo, e a infecção com este organismo é mais fácil de diagnosticar do que a infecção com outras espécies de Legionella e serogrupos. Em algumas regiões, outras espécies e serogrupos são mais importantes. Por exemplo, Legionella longbeachae é uma das principais causas de legionelose na Austrália e Nova Zelândia, onde está frequentemente associada à exposição à mistura de vasos. A infecção com esta espécie não será detectada pelos testes atuais de antígenos urinários e será perdida pelos laboratórios que realizam testes serológicos apenas para L. pneumophila.

Cultura

O diagnóstico da cultura requer meios especiais, processamento adequado dos espécimes, e perícia técnica (tabela 1). São necessários vários dias para se obter um resultado positivo, com a maioria das colônias de Legionella sendo detectada dentro de 3-5 dias. O meio padrão utilizado para o cultivo de legionella é o extrato de levedura de carvão vegetal tamponado (BCYE) ágar suplementado com α-ketoglutarate, com ou sem agentes antimicrobianos. Este meio fornece ferro e L-cisteína, ambos essenciais para o crescimento das legionellae. O crescimento de algumas espécies de Legionella (por exemplo, Legionella micdadei e Legionella bozemanii) é potenciado pela suplementação de ágar BCYE com albumina de soro bovino, e a adição de corantes indicadores ao meio pode ajudar na identificação. Meios de cultura contendo cefamandole inibirão o crescimento de espécies de Legionella que não produzem β-lactamase, como L. micdadei e L. bozemanii .

Legionellae pode ser isolada de uma variedade de tipos de amostra, embora as secreções das vias respiratórias inferiores (por exemplo expectoração e amostras de broncoscopia) são as amostras de escolha. A maior limitação da cultura da expectoração é que menos da metade dos pacientes com doença do legionário produzem expectoração. Outros factores influenciam a sensibilidade da cultura uma vez obtida uma amostra de expectoração. A bactéria Legionella pode sobreviver mal nas secreções respiratórias, e estas amostras devem ser processadas prontamente. Alguns doentes com doença do legionário produzem expectoração com relativamente pouca purulência; estas amostras podem ser rejeitadas por laboratórios que eliminam amostras de expectoração contendo poucos leucócitos polimorfonucleares . Consequentemente, os critérios de rejeição não devem ser aplicados às amostras de escarro enviadas para cultura de Legionella. A experiência do pessoal do laboratório também é importante, e laboratórios experientes em cultura de Legionella têm maior probabilidade de recuperar o organismo.

As sensibilidades estimadas da cultura da expectoração variam de <10% a ∼80% e variam de acordo com diferentes padrões de comparação e por laboratórios individuais . Na prática, os melhores resultados provavelmente só serão alcançados por laboratórios com um interesse especial na infecção pela Legionella, e as sensibilidades são geralmente <50% quando os achados serológicos são usados como padrão. Amostras broncoscópicas são susceptíveis de produzir um maior rendimento diagnóstico do que as amostras de expectoração expectante.

As espécies de Legionella podem ser isoladas das culturas de sangue, mas o rendimento é fraco. O crescimento das legionelas é mantido pelos meios de cultura de sangue de rotina, mas pode não activar o alarme das máquinas de cultura de sangue comerciais . Consequentemente, são necessárias subculturas cegas em meios sólidos. Em geral, a produção de hemoculturas é baixa e é pouco provável que influencie a gestão clínica.

Anticorpo Fluorescente Directo (Dfa) Coloração

A coloraçãoDFA pode detectar legionellae nas secreções respiratórias e amostras de tecido. Esta técnica tem a vantagem de fornecer um resultado dentro de 2-4 h, mas é tecnicamente exigente e deve ser realizada por pessoal de laboratório experiente. As sensibilidades relatadas da coloração de DFA variam, são consistentemente menores do que as do cultivo, e são menos precisamente conhecidas para outras espécies que não L. pneumophila. Para as secreções das vias respiratórias inferiores, as sensibilidades geralmente têm uma variação de 25%-66%, com amostras de fluido de lavagem broncoalveolar com maior rendimento do que as amostras transtraqueal ou de expectoração. A especificidade da coloração de DFA foi estimada em ∼94% , embora o teste seja provavelmente menos específico em mãos inexperientes. Resultados falso-positivos podem ocorrer devido a reações cruzadas com outras bactérias, incluindo Bacteroides fragilis, Pseudomonas, Stenotrophomonas, e Flavobacterium. As reações cruzadas podem ser menos problemáticas quando são usados agentes monoclonais-anticorpos DFA. Problemas de sensibilidade e especificidade têm limitado o uso da coloração de DFA, e um resultado positivo de DFA na ausência de outras evidências de suporte não é agora geralmente aceite como suficiente para o diagnóstico da infecção por Legionella.

Detecção de Antigénio Urinário

Detecção do antigénio de Legionella solúvel em amostras de urina é um método rápido que fornece um diagnóstico precoce da infecção por Legionella e tem sido uma ferramenta útil para a investigação de surtos de doença do legionário . Os kits comerciais que utilizam ambas as metodologias RIA e EIA estão disponíveis há vários anos e têm características de desempenho semelhantes. Recentemente, foi desenvolvido um ensaio imunocromatográfico (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax) que tem sensibilidade e especificidade semelhantes à AIA . Este teste é fácil de realizar e pode fornecer um resultado dentro de 15 min.

Para a detecção de L. pneumophila serogroup 1, os testes de antígeno urinário têm sensibilidades na faixa de 70%-100% e especificidades próximas de 100% . As sensibilidades podem ser aumentadas em até 20% por 25 vezes a concentração das amostras de urina antes dos testes . A maior desvantagem destes testes é a sua incapacidade de detectar de forma confiável outros organismos que não o L. pneumophila serogroup 1. Foram desenvolvidos ensaios de amplo espectro que detectam antígenos solúveis de uma grande variedade de espécies de Legionella, mas que não estão disponíveis comercialmente. O Biotest Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) destina-se a detectar legionellae que não L. pneumophila serogroup 1, mas fá-lo de forma menos fiável do que detecta L. pneumophila serogroup 1 . Resultados de antígenos urinários falso-positivos ocorreram em pacientes com doença sérica .

Antigénio de L. pneumophila pode ser detectado logo 1 dia após o início dos sintomas e persiste durante dias a semanas. Em um caso, a excreção do antígeno foi documentada para ocorrer por >300 dias . Antígenos de Legionella solúveis também foram detectados em outras amostras além da urina, incluindo amostras de expectoração, tecido pulmonar, soro e líquido pleural, embora o uso de tais amostras não tenha sido totalmente avaliado.

Teste de antígeno urinário é agora uma ferramenta estabelecida e valiosa para o diagnóstico da doença do legionário, particularmente em regiões onde o serogrupo 1 de L. pneumophila é a causa mais comum da doença. Em locais onde apenas uma minoria das infecções é causada por L. pneumophila serogroup 1, os ensaios de antígeno urinário actualmente disponíveis contribuem menos para os testes laboratoriais existentes.

Testes serológicos

Testes serológicos para a infecção por Legionella é uma ferramenta epidemiológica valiosa mas tem pouco impacto na tomada de decisões clínicas devido ao tempo de espera até que um resultado esteja disponível. Os anticorpos produzidos em resposta à infecção são geralmente uma mistura de IgA, IgM, e IgG, e os testes devem detectar todos os tipos para uma sensibilidade óptima. A medição de IgM específico é um marcador não confiável de infecção aguda, porque os anticorpos IgM podem persistir por longos períodos de tempo. A seroconversão pode demorar várias semanas, o que é uma grande limitação dos testes serológicos. Na maioria dos casos, um aumento de 4 vezes no título de anticorpos é detectado dentro de 3-4 semanas, mas em alguns casos, isto pode levar >10 semanas . A obtenção de amostras de soro em fase de convalescença demasiado cedo resulta, sem dúvida, em muitos resultados falso-negativos e é provavelmente responsável em parte pelos 20%-30% dos doentes com doença do legionário que supostamente não desenvolvem uma resposta de anticorpos detectável . No entanto, é claro que uma proporção de pessoas com infecção comprovada por Legionella não tem seroconversão detectável. Na prática, os clínicos devem ser encorajados a obter amostras de soro em fase de convalescença 3 semanas após o início da doença para testes em paralelo com o soro obtido durante a fase aguda. Se não houver seroconversão após este período de tempo e ainda houver suspeita de infecção por Legionella, deve ser obtida uma amostra adicional da fase de convalescença.

Dos vários métodos de detecção de anticorpos disponíveis, a imunofluorescência indirecta é o teste de referência padrão. Um aumento de 4 vezes ou mais no título de anticorpos recíprocos para ⩾128 é considerado diagnóstico. Os títulos de anticorpos recíprocos em fase aguda do ⩾256 na presença de pneumonia foram considerados suficientes para um diagnóstico presuntivo, mas isso se mostrou não confiável, especialmente dada a alta prevalência de positividade de anticorpos Legionella entre algumas pessoas sem evidência clínica de legionelose. Não há praticamente nenhum papel para testar uma única amostra de soro.

Outra desvantagem dos testes serológicos é a incapacidade de detectar com precisão todas as espécies de Legionella e serogrupos de Legionella. Embora a seroconversão para L. pneumophila serogrupo 1 seja geralmente considerada como sendo altamente preditiva da doença, a sensibilidade e especificidade da seroconversão para outras espécies e serogrupos não tem sido rigorosamente confirmada. Além disso, a formação de anticorpos reactivos cruzados entre os membros da família Legionellaceae pode dificultar a determinação da espécie ou do serogrupo infectante. Alguns doentes com infecção não-L. pneumophila serogrupo 1 terão seroconversão para L. pneumophila serogrupo 1 . Por outro lado, a identificação sequencial dos produtos de Legionella PCR de pacientes que tiveram seroconversão para outras espécies de Legionella que não L. pneumophila indica que alguns foram provavelmente infectados com L. pneumophila (observações não publicadas). Anticorpos reativos cruzados também são ocasionalmente encontrados em pacientes com infecções causadas por bactérias não-Legionella, incluindo pseudomonas, micobactérias, espécies Bacteroides, e espécies Campylobacter. Uma reação cruzada interessante ocorre entre L. bozemanii e Rickettsia typhi como resultado de um antígeno compartilhado .

Amplificação do Ácido Nucleico

Recentemente, as técnicas de detecção de DNA têm mostrado promessa para o diagnóstico rápido da infecção por Legionella. A PCR permite a amplificação específica de quantidades mínimas de ADN de Legionella, fornece resultados num curto espaço de tempo e tem o potencial de detectar infecções causadas por qualquer espécie de Legionella e serogrupo. Actualmente, a Legionella PCR só está disponível num número limitado de laboratórios que utilizam uma variedade de ensaios internos.

PCR tem sido utilizada com sucesso para detectar o ADN da Legionella numa variedade de amostras ambientais e clínicas. Ao testar amostras do tracto respiratório inferior, foi demonstrado repetidamente que a PCR tem uma sensibilidade igual ou superior à da cultura . Na verdade, a PCR pode ser considerada o teste de escolha para pacientes que produzem expectoração. O papel da PCR para testar outros tipos de amostras é menos claro. O DNA da Legionella pode ser detectado em amostras de urina, soro e leucócitos obtidos de pacientes com doença do legionário com sensibilidade de 30%-86% . A sensibilidade da PCR é susceptível de aumentar quando se testa amostras que são obtidas no início da doença e quando se testa >1 tipo de amostra de cada paciente . Os esfregaços de garganta também podem ser uma amostra adequada para testes de PCR, mas esta aplicação só foi avaliada em um único estudo .

Outros trabalhos são necessários para estabelecer um método padrão de PCR que será suficientemente robusto para ser usado fora do ambiente de um laboratório de pesquisa. Sua aplicação em amostras não-respeitadoras é particularmente atrativa, pois isso contornará o problema de pacientes que não produzem amostras de expectoração. O desenvolvimento de um ensaio de PCR ideal tem sido complicado pela contaminação intermitente de alguns kits comerciais de extração de DNA com DNA de Legionella . A utilização destes kits para processar amostras pode resultar em resultados falso-positivos e sublinha a importância de incluir controlos adequados em cada ensaio.

Estratégia de teste

Porque a doença do legionário não pode ser clinica ou radiograficamente distinguida de outras causas de pneumonia, a decisão de testar a infecção por Legionella pode ser difícil e é muitas vezes tomada de forma errática. É importante estar familiarizado com a epidemiologia local. Alguns laboratórios em áreas onde as espécies de Legionella são uma causa comum de pneumonia optaram por cultivar rotineiramente todas as amostras de expectoração obtidas de pacientes com pneumonia nos meios de Legionella. Poucos laboratórios, no entanto, seriam capazes de justificar o custo adicional associado com a cultura de rotina de Legionella. Na maioria dos locais, a incidência da infecção por Legionella é desconhecida, e a decisão de pedir testes diagnósticos para a infecção por Legionella é geralmente limitada a pacientes em risco, a pacientes com pneumonia grave, e a cenários de surtos. É certamente possível selecionar um subconjunto de pacientes para os quais o rendimento dos testes diagnósticos da Legionella é provavelmente relativamente alto. Este grupo inclui idosos, fumantes, indivíduos imunossuprimidos, aqueles com doença pulmonar crônica, pacientes que residem em hospitais com suprimento de água colonizada por Legionella, e indivíduos expostos à mistura de potting mix. A incidência de doença do legionário é maior entre pacientes com pneumonia grave, e todos os pacientes com pneumonia que são admitidos em uma unidade de terapia intensiva devem ser testados para esta infecção.

Em locais onde L. pneumophila serogrupo 1 é a causa predominante da infecção por Legionella, ou durante um surto de infecção com L. pneumophila serogrupo 1, o teste de antígeno urinário é uma ferramenta diagnóstica particularmente valiosa. O desenvolvimento de um teste de antígeno urinário comercial que também detecte de forma confiável outros patógenos da Legionella humana seria um grande avanço e provavelmente faria deste o teste de diagnóstico de escolha em quase todos os ambientes. Em localizações geográficas onde outras legionelas além da L. pneumophila serogrupo 1 são patógenos numericamente importantes, os testes atuais de antígenos urinários ainda são úteis, mas não devem ser usados como a única ferramenta diagnóstica. Se disponível, a Legionella PCR combinada com o teste de antígeno urinário é provavelmente a melhor estratégia inicial de teste que irá detectar todas as espécies de Legionella e fornecer resultados dentro de um período de tempo que irá afetar o manejo clínico.

Onde a PCR não está disponível, o teste de antígeno urinário combinado com a cultura de amostras do trato respiratório inferior é a melhor combinação de teste. A cultura continua a ser uma ferramenta de diagnóstico importante, mas a sua sensibilidade relativamente baixa e a confiança na disponibilidade de uma amostra do tracto respiratório inferior tornam-na inadequada como único teste de diagnóstico. Embora o teste serológico não tenha impacto no manejo inicial, pode ser útil se um diagnóstico específico não for feito durante a fase aguda da infecção, mas tanto as amostras de fase aguda como as de fase de convalescença devem ser testadas em paralelo. Durante uma suspeita de surto de doença do legionário, uma abordagem agressiva ao diagnóstico é necessária, o que envolveria o uso de uma combinação de métodos de teste.

As espécies de Legionella podem ocasionalmente causar febre de Pontiac, uma doença aguda, febril e não pneumónica caracterizada por uma alta taxa de ataque, curto período de incubação e rápida recuperação. O diagnóstico da febre de Pontiac geralmente depende do reconhecimento de características clínicas típicas durante uma situação de surto, e o diagnóstico é confirmado por testes serológicos das pessoas afetadas. O uso da cultura é largamente limitado ao teste de amostras ambientais para determinar a origem do surto, embora L. pneumophila serogrupo 1 tenha sido isolada de um aspirado traqueal de uma criança com febre de Pontiac .

Conclusões

Infecção por Legionella é sem dúvida subreconhecida. O diagnóstico depende do uso de testes especializados, muitas vezes em combinação. Testes de antígenos urinários, cultura de expectoração e PCR de amostras do trato respiratório inferior são as ferramentas diagnósticas mais importantes para a detecção precoce da infecção por Legionella no curso da doença. O desenvolvimento de testes de antigénios urinários que detectam uma gama mais vasta de legionelas patogénicas e o desenvolvimento de testes PCR padronizados serão os principais avanços no diagnóstico da Legionella. A maior disponibilidade e uso de testes de diagnóstico melhorados ajudará a caracterizar melhor a epidemiologia da doença do legionário, incluindo a verdadeira incidência e variação geográfica.

Acknowledgments

I am grateful to Steve Chambers for helpful comments on the article in manuscript.

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