Die Komponenten eines grundlegenden Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystems sind in dem einfachen Diagramm in Abbildung E dargestellt.
Ein Reservoir enthält das Lösungsmittel. Eine Hochdruckpumpe wird verwendet, um eine bestimmte Durchflussrate der mobilen Phase zu erzeugen und zu dosieren, typischerweise Milliliter pro Minute. Ein Injektor kann die Probe in den kontinuierlich fließenden Strom der mobilen Phase einbringen, der die Probe in die HPLC-Säule befördert. Die Säule enthält das chromatographische Packungsmaterial, das für die Trennung benötigt wird. Dieses Packungsmaterial wird als stationäre Phase bezeichnet, da es von der Säulenhardware festgehalten wird. Ein Detektor wird benötigt, um die getrennten Substanzbanden zu sehen, wenn sie aus der HPLC-Säule eluieren. Die mobile Phase verlässt den Detektor und kann je nach Wunsch in den Abfall geleitet oder gesammelt werden. Wenn die mobile Phase eine abgetrennte Substanzbande enthält, bietet die HPLC die Möglichkeit, diese Fraktion des Eluats, die diese gereinigte Substanz enthält, für weitere Untersuchungen zu sammeln. Dies wird als präparative Chromatographie bezeichnet.
Beachten Sie, dass Hochdruckschläuche und -anschlüsse verwendet werden, um die Pumpe, den Injektor, die Säule und die Detektorkomponenten miteinander zu verbinden, um die Leitung für die mobile Phase, die Probe und die getrennten Verbindungsbanden zu bilden.
Abbildung E: Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesystem
Der Detektor ist mit der Computer-Datenstation verbunden, der Komponente des HPLC-Systems, die das elektrische Signal aufzeichnet, das zur Erzeugung des Chromatogramms auf dem Display und zur Identifizierung und Quantifizierung der Konzentration der Probenbestandteile benötigt wird (siehe Abbildung F). Da die Eigenschaften der Probenbestandteile sehr unterschiedlich sein können, wurden verschiedene Arten von Detektoren entwickelt. Wenn eine Verbindung beispielsweise ultraviolettes Licht absorbieren kann, wird ein UV-Absorptionsdetektor verwendet. Wenn die Verbindung fluoresziert, wird ein Fluoreszenzdetektor verwendet. Weist die Verbindung keine dieser Eigenschaften auf, wird ein universellerer Detektortyp verwendet, z. B. ein Verdunstungslichtstreudetektor. Der leistungsfähigste Ansatz ist die Verwendung mehrerer Detektoren in Reihe. So kann beispielsweise ein UV- und/oder ELSD-Detektor in Kombination mit einem Massenspektrometer verwendet werden, um die Ergebnisse der chromatografischen Trennung zu analysieren. Dies liefert mit einer einzigen Injektion umfassendere Informationen über einen Analyten. Die Kopplung eines Massenspektrometers mit einem HPLC-System wird als LC/MS bezeichnet.
Abbildung F: Ein typisches HPLC-System
HPLC-Betrieb
Ein einfacher Weg, um zu verstehen, wie wir die Trennung der in einer Probe enthaltenen Verbindungen erreichen, ist die Betrachtung des Diagramms in Abbildung G.
Die mobile Phase tritt von links in die Säule ein, passiert das Partikelbett und verlässt sie rechts. Die Strömungsrichtung wird durch grüne Pfeile dargestellt. Das obere Bild zeigt die Säule zum Zeitpunkt Null, wenn die Probe in die Säule eintritt und beginnt, ein Band zu bilden. Die hier gezeigte Probe, ein Gemisch aus gelben, roten und blauen Farbstoffen, erscheint am Einlass der Säule als eine einzige schwarze Bande.
Nach einigen Minuten, in denen die mobile Phase kontinuierlich und gleichmäßig an den Partikeln des Füllmaterials vorbeifließt, ist zu erkennen, dass sich die einzelnen Farbstoffe in getrennten Banden mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegt haben. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die mobile Phase und die stationäre Phase um die Anziehung der einzelnen Farbstoffe oder Analyten konkurrieren. Beachten Sie, dass sich die gelbe Farbstoffbande am schnellsten bewegt und im Begriff ist, die Säule zu verlassen. Der gelbe Farbstoff mag die mobile Phase mehr als die anderen Farbstoffe. Daher bewegt er sich mit höherer Geschwindigkeit, näher an der mobilen Phase. Die blaue Farbstoffbande mag das Verpackungsmaterial mehr als die mobile Phase. Aufgrund seiner stärkeren Anziehungskraft auf die Partikel bewegt er sich deutlich langsamer. Mit anderen Worten: Sie ist die am stärksten zurückgehaltene Verbindung in diesem Probengemisch. Die rote Farbstoffbande hat eine mittlere Anziehungskraft für die mobile Phase und bewegt sich daher mit einer mittleren Geschwindigkeit durch die Säule. Da sich jede Farbstoffbande mit unterschiedlicher Geschwindigkeit bewegt, können wir sie chromatographisch trennen.
Abbildung G: Verständnis der Funktionsweise einer chromatographischen Säule – Banden
Was ist ein Detektor?
Wenn die getrennten Farbstoffbanden die Säule verlassen, gelangen sie sofort in den Detektor. Der Detektor enthält eine Durchflusszelle, die jede getrennte Bande vor dem Hintergrund der mobilen Phase sieht. Ein geeigneter Detektor ist in der Lage, das Vorhandensein einer Verbindung zu erkennen und das entsprechende elektrische Signal an eine Computerdatenstation zu senden. Je nach den Eigenschaften und Konzentrationen der zu trennenden und zu analysierenden Verbindungen kann zwischen vielen verschiedenen Detektortypen gewählt werden, wie bereits erwähnt.
Was ist ein Chromatogramm?
Ein Chromatogramm ist eine Darstellung der Trennung, die chemisch im HPLC-System stattgefunden hat. Eine Reihe von Peaks, die von einer Basislinie aus ansteigen, wird auf einer Zeitachse dargestellt. Jeder Peak stellt die Detektorreaktion für eine andere Verbindung dar. Das Chromatogramm wird von der Computerdatenstation aufgezeichnet.
Abbildung H: Wie Peaks entstehen
In Abbildung H hat das gelbe Band die Durchflusszelle des Detektors vollständig durchlaufen; das erzeugte elektrische Signal wurde an die Computerdatenstation gesendet. Das resultierende Chromatogramm erscheint nun auf dem Bildschirm. Man beachte, dass das Chromatogramm mit der ersten Injektion der Probe beginnt und sich als gerade Linie am unteren Rand des Bildschirms abzeichnet. Dies wird als Basislinie bezeichnet; sie stellt die reine mobile Phase dar, die im Laufe der Zeit durch die Durchflusszelle fließt. Wenn die gelbe Analytbande durch die Durchflusszelle läuft, wird ein stärkeres Signal an den Computer gesendet. Die Linie krümmt sich zunächst nach oben und dann nach unten, und zwar im Verhältnis zur Konzentration des gelben Farbstoffs in der Probenbande. Dadurch entsteht ein Peak im Chromatogramm. Nachdem die gelbe Bande die Detektorzelle vollständig verlassen hat, kehrt der Signalpegel zur Basislinie zurück; in der Durchflusszelle befindet sich nun wieder nur reine mobile Phase. Da sich die gelbe Bande am schnellsten bewegt und zuerst aus der Säule eluiert, ist sie der erste Peak, der gezeichnet wird.
Etwas später erreicht die rote Bande die Durchflusszelle. Das Signal steigt von der Basislinie an, wenn die rote Bande in die Zelle eintritt, und der Peak, der die rote Bande repräsentiert, wird gezeichnet. In diesem Diagramm hat das rote Band die Durchflusszelle noch nicht vollständig durchquert. Das Diagramm zeigt, wie die rote Bande und der rote Peak aussehen würden, wenn wir den Prozess zu diesem Zeitpunkt anhalten würden. Da der größte Teil des roten Bandes die Zelle durchlaufen hat, ist auch der größte Teil des Peaks gezeichnet worden, wie die durchgezogene Linie zeigt. Wenn wir den Prozess erneut starten könnten, würde die rote Bande die Durchflusszelle vollständig durchlaufen und der rote Peak wäre fertig. Die blaue Bande, die am stärksten zurückgehalten wird, bewegt sich am langsamsten und eluiert nach der roten Bande. Die gepunktete Linie zeigt Ihnen, wie das fertige Chromatogramm aussehen würde, wenn wir den Lauf bis zum Ende fortgesetzt hätten. Interessanterweise ist die Breite des blauen Peaks am größten, weil die blaue Analytbande zwar auf der Säule am schmalsten ist, aber beim Eluieren von der Säule am breitesten wird. Dies liegt daran, dass sie sich langsamer durch das Bett des chromatographischen Füllmaterials bewegt und mehr Zeit benötigt, um vollständig eluiert zu werden. Da die mobile Phase kontinuierlich mit einer festen Rate fließt, bedeutet dies, dass die blaue Bande breiter und verdünnter wird. Da der Detektor proportional zur Konzentration der Bande anspricht, ist der blaue Peak weniger hoch, aber breiter.