Vergleich von DNA-Quantität und -Qualität durch Speichelsammlung nach dem Verzehr von Nahrungsmitteln und Getränken

Materialien und Methoden

Wir erhielten die Genehmigung des institutionellen Prüfungsausschusses für den Schutz von Menschen des Air Force Research Laboratory, Protokollnummer FWR20180101H. Die Probanden wurden individuell aufgeklärt und unterschrieben die Einverständniserklärung, die von einer dritten Person bezeugt wurde. Von fünf Probanden wurden Proben mit dem Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab (Epicentre, Madison, WI) und dem Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit (Isohelix, Kent, UK) entnommen. Alle gesammelten Proben wurden am selben Tag mit einem Abstand von mindestens 30 Minuten zwischen den einzelnen Entnahmen oder im Laufe von drei Tagen entnommen, da die Teilnehmer zeitliche Beschränkungen hatten. Pro Proband wurden zwei Abstriche entnommen; jeder Abstrich wurde 10-15 s lang an der Innenseite jeder Wange gerieben. Sechs Spuckproben wurden entnommen: gemäß den Anweisungen des Herstellers unmittelbar nach dem Trinken von Wasser, dem Mittagessen, dem Trinken eines kohlensäurehaltigen Erfrischungsgetränks, dem Trinken eines Sportgetränks oder dem Trinken von Kaffee.

Die Abstriche wurden mit der Epicentre QuickExtract™ DNA-Extraktionslösung 1.0 (Epicentre) extrahiert. Der erste Abstrich wurde so verarbeitet, wie er ist, und der zweite wurde mit dem Wizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) unter Verwendung des Mikrozentrifugenprotokolls für die Aufreinigung genomischer DNA aus Gewebekultur-Zelllysaten gereinigt. Es gab keinen Zellwaschschritt, da die Proben bereits in Lösung waren. Die Spuckproben wurden mit dem QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) unter Verwendung des modifizierten Speichel-Extraktionsprotokolls des Herstellers extrahiert.

Proben wurden mit dem NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) und dem Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) mit dem Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit quantifiziert. Das NanoDrop wurde auch zur Beurteilung der Reinheit der Proben verwendet, indem die Absorptionswerte bei 260 und 280 nm (A260/A280) verglichen wurden. Beide wurden gemäß den Herstellerprotokollen verwendet. Die extrahierten Proben, die auf der Grundlage der Qubit-Konzentrationen auf 10 ng/μL normalisiert wurden, wurden mit einem 2%igen E-Gel® Precast-Agarosegel (Thermo Fisher Scientific) analysiert. Der Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) wurde zusammen mit dem High Sensitivity DNA Chip verwendet, um die Qualität der extrahierten DNA zu bestimmen.

Die Proben wurden dann mit dem Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) analysiert, um auf zwei genetische Marker zu testen, die mit Erdnussallergien in Verbindung stehen: rs7192 und rs9275596 . Genotypisierung mit einer schnellen Rampe vor der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei 60 °C für 1 min, einem Haltezyklus bei 95 °C für 10 min, 40 Zyklen bei 95 °C für 15 s, dann 60 °C für 1 min und einer Post-PCR bei 60 °C für 1 min. Es wurde der TaqPath ProAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Die Assays für Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) wurden in der Hälfte der vom Hersteller empfohlenen Konzentration verwendet. Das Endvolumen betrug 10 µL.

Ergebnisse

Die Tupfextraktionsmethode unter Verwendung der QuickExtract-Lösung führte zu einer hohen DNA-Menge. Die Werte der aus dem Abstrich ohne weitere Bearbeitung gewonnenen DNA reichten von 1,38 bis 54,2 pg/µL, wie mit dem Bioanalyzer bestimmt (Additional file 1: Table S1). Frühere, nicht veröffentlichte Ergebnisse aus unserem Labor haben jedoch gezeigt, dass Sequenzierungsexperimente gehemmt wurden, wenn Bibliotheken direkt aus den QuickExtract-Lösungsextraktionen hergestellt wurden. Daher haben wir diese Proben mit einem Wizard-Säulenreinigungsprotokoll aufgereinigt, wodurch die Konzentration wie erwartet sank (zwischen 2,59 und 38,2 pg/µL) und die A260/A280-Verhältnisse näher an den allgemein akzeptierten Bereich (1,8-2,1) herankamen.

Spuckproben, die nach dem Herstellerprotokoll gesammelt und mit dem QIAamp Blood DNA Kit extrahiert wurden, hatten einen Bereich von 1,01 ng/μL bis 8,20 ng/μL. Die durch die A260/A280-Messung angezeigte Reinheit lag typischerweise im Bereich der DNA (siehe Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Keine der Spuckproben, die gesammelt wurden, nachdem die Probanden verschiedene Getränke getrunken oder zu Mittag gegessen hatten, wiesen DNA-Konzentrationen und Reinheitsmesswerte auf, die sich signifikant von denen unterschieden, die nach dem Protokoll des Herstellers (30 Minuten Fasten) gesammelt wurden (Abb. 1).

Extrahierte Proben, die auf 10 ng/μL normalisiert wurden, wie durch Qubit 4.0-Messungen bestimmt, wurden auf einem 2 %igen E-Gel unter Verwendung einer 1-kb-Leiter ausgeführt (Additional file 1: Abbildung S1). Wir erwarteten eine Bande im oberen Bereich des Gels, die eine DNA-Extraktion mit hohem Molekulargewicht darstellt. Wie erwartet, wies die extrahierte DNA aus den verschiedenen Speichelsammelmethoden ein hohes Molekulargewicht auf. Trotz der Normalisierung auf einen Input von 10 ng/µl ergab sich bei den meisten Abstrichproben keine klare Bande, was entweder auf das Vorhandensein von Ladungsinterferenzen oder ein anderes systematisches Problem schließen lässt.

Eine detailliertere Größen- und Reinheitsanalyse auf einem Bioanalyzer zeigte, dass alle Proben und alle Bedingungen überwiegend DNA mit hohem Molekulargewicht und ähnlichen Konzentrationen enthielten (Abb. 2). Abgesehen von der bereits erwähnten niedrigen Konzentration nach der Reinigung der Abstrichextraktion gibt es keine mit der Entnahmebedingung (Essen oder Trinken) zusammenhängenden Trends in Bezug auf DNA-Qualität, -Größe oder -Konzentration, die bei der Analyse der Elektropherogrammsignale deutlich werden. Es scheint eine subjektabhängige Veränderung zu geben, obwohl dieses Phänomen nicht weiter verfolgt wurde.

Schließlich testeten wir mit Hilfe der SNP-Genotypisierung die Eignung der extrahierten DNA für nachfolgende molekulare Prozesse (Abb. 3). Alle extrahierten Proben aller Probanden waren erfolgreich in der Lage, brauchbare Ergebnisse für die Genotypisierung von zwei mit Erdnussallergien assoziierten SNPs zu liefern, mit Ausnahme einer der gereinigten Tupferproben (Proband 5B).

Diskussion

Bei der Konzeption einer genetischen Forschungsstudie, eines kommerziellen Produkts oder einer Maßnahme im Gesundheitswesen sind Benutzerfreundlichkeit und die Einhaltung der Vorschriften durch den Endbenutzer zwei entscheidende Faktoren. Blutentnahmegeräte, bei denen man sich in die Haut stechen muss, können aufgrund von Schmerzabneigung eine geringere Akzeptanz aufweisen. Aus Beobachtungen in unserem Labor haben wir anekdotisch eine geringere Teilnahmequote an Studien festgestellt, wenn der primäre Unterschied in der Venenpunktion gegenüber der Speichelentnahme besteht. Wir haben keine kontrollierte Studie durchgeführt, um dieses Phänomen zu untersuchen; stattdessen haben wir uns für die Speichelprobenentnahme entschieden, weil sie einfach anzuwenden ist, die Teilnehmerzahl offensichtlich steigt und die Art von Forschungsstudien in unserem Labor vorherrscht. Da unsere Studien die Selbstverabreichung der Speichelproben beinhalten, wollten wir feststellen, ob eine ausreichende Menge und Qualität an DNA vorhanden ist, die für nachgelagerte molekulare Anwendungen verwendet werden kann, und zwar unter verschiedenen wahrscheinlichen Bedingungen bei der Probenahme vor Ort, vor allem bei der Aufnahme verschiedener Nahrungsmittel und Getränke. Das Studiendesign war nicht auf einen Vergleich zwischen den Individuen ausgerichtet, sondern auf den Vergleich der Variabilität der Probenentnahme innerhalb eines Probanden. Mit diesem Ziel vor Augen konnten wir keine signifikante Verringerung der DNA-Mengen feststellen, die durch eine Abweichung von den Anweisungen des Herstellers, vor der Entnahme 30 Minuten zu fasten, verursacht wurde.

Obwohl die Quantität der DNA wichtig ist, ist die Qualität der gewonnenen DNA für fortgeschrittene molekularbiologische Techniken noch entscheidender. In unserer Studie haben wir festgestellt, dass die Entnahme von Speichelproben nach dem Essen und Trinken keinen Einfluss auf die Ausbeute an hochmolekularer DNA hatte. Diese DNA ist für die Sequenzierung der nächsten Generation, das Scannen von Arrays und die PCR-Genotypisierung von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus zeigte ein experimenteller Test mit zwei unabhängigen genetischen Targets in der PCR-Genotypisierung, dass diese Proben für molekulare Analysen geeignet waren.

Unser Ziel mit dieser Studie war es, herauszufinden, ob die Qualität und Quantität der DNA aus der Speichelsammlung durch ein Speichel-DNA-Sammelkit beeinträchtigt wird, wenn die Anweisungen des Herstellers nicht befolgt werden, d. h. wenn unmittelbar vor der Sammlung getrunken oder gegessen wird. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese konnten wir keinen Unterschied in der Quantität oder Qualität der isolierten DNA feststellen.

Schlussfolgerung

Genetische Studien haben sich über den Bereich rein wissenschaftlicher Bestrebungen hinaus ausgedehnt und sind heute in der Öffentlichkeit weit verbreitet. Um menschliche Proben für diese Studien zu optimieren, bemühen sich die Hersteller um die Entwicklung einfacher, robuster Entnahmeverfahren. Die Speichelentnahme ist die am wenigsten invasive dieser Methoden, liefert qualitativ hochwertige DNA und bietet eine ausgezeichnete Produktstabilität. Unsere Studie über die aus dem Speichel gewonnene DNA nach dem Verzehr verschiedener Getränke und/oder Snacks hat gezeigt, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Quantität und Qualität der mit dem Isohelix GeneFiX Saliva DNA Collection Kit (Isohelix) gesammelten DNA gibt, wenn die Proben nicht gemäß dem Herstellerprotokoll gesammelt werden. Auch wenn die Stichprobengröße in dieser Studie gering ist, stimmen die Beobachtungen aus anderen Studien in unserem Labor mit den Ergebnissen unseres hier vorgestellten systematischen Vergleichs überein. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die Speichelsammlung eine robuste, nicht invasive Methode ist, um Proben sowohl im Labor als auch im Feld zu sammeln, und dass die 30-minütige Anforderung, auf Essen und Trinken zu verzichten, ein Ideal und kein absolutes Kriterium ist.