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DNEs IN DER TRANSKRIPTIONSREGULIERUNG

DNEs können auch im Zusammenhang mit der Transkriptionsregulation auftreten. Ein DNE kann beispielsweise durch Entfernen der Transaktivierungsdomäne eines modularen TF entstehen, wobei nur die DNA-Bindungsdomäne übrig bleibt. Dieser verkürzte Faktor kann sich als kompetitiver Inhibitor der Transkription verhalten. Es ist bekannt, dass dies in der Natur vorkommt. Beispielsweise wird das C/EBP-Protein bei Säugetieren in Form von drei alternativen Polypeptiden exprimiert. Die längeren Polypeptide enthalten eine N-terminale Transkriptionsaktivierungsdomäne, während diese bei der kurzen Form fehlt. Da sich die langen und kurzen Isoformen zu Homo- und Heterodimeren zusammenfügen, verhält sich letztere wie eine natürliche DN (Zahnow et al., 1997). Dies gilt auch für die Stats 5 und 6 in Wirbeltieren, die in der Lage sind, zu dimerisieren. Ihre proteolytische Verarbeitung als Reaktion auf physiologische Signale führt zur Entfernung der C-terminalen Aktivierungsdomäne und verwandelt sie in starke Inhibitoren, die die Signaltransduktion negativ regulieren (Nakajima et al., 2003). In Pflanzen fungiert eine große Anzahl von MYB-Proteinen als Transkriptionsregulatoren. In Arabidopsis sind Proteine, die eine einzelne MYB-DNA-Bindungswiederholung enthalten, denen aber die Transaktivierungsdomäne fehlt, an der Spezifizierung von Aspekten des epidermalen Zellschicksals beteiligt. Diese Proteine interagieren mit anderen TFs, einschließlich bHLH-Proteinen, und aufgrund des Fehlens einer Transaktivierungsdomäne verhalten sie sich als DN- und trans-DNs, indem sie inaktive Komplexe bilden (Ramsay und Glover, 2005).

Das Entfernen der DNA-Bindungsdomäne kann ebenfalls zu DNEs führen. Dies geschieht bei bHLH TFs. Wie bereits erwähnt, kodiert das Id-1-Gen für einen natürlich vorkommenden DN-Inhibitor dieser Familie von TFs. Vollständige bHLH-Proteine (mit DNA-Bindungs- und Dimerisierungsdomänen) können konstitutiv exprimiert werden. Die regulierte Expression von Id-1, das nur die Dimerisierungsdomäne enthält, führt jedoch zu einer Regulierung der Aktivität der bHLH-Proteine (Sun, 1994). Ein ähnliches Phänomen ist auch bei Pflanzen zu erwarten. So kodiert das Genom von Arabidopsis für ∼120 bHLH-Proteine, von denen vorhergesagt wird, dass sie DNA binden, und für 27 Proteine mit einer weniger basischen Region als für die Bindung erforderlich (Toledo-Ortiz et al., 2003). Diese nicht DNA-bindenden HLHs könnten wie tierische Id-Proteine als negative Regulatoren von bHLH-Proteinen fungieren, indem sie Heterodimere bilden, die keine DNA binden können (Toledo-Ortiz et al., 2003). Ähnliche Effekte werden bei TFs erwartet, die zur Familie der Basic Domain/Leucine Zipper (bZIP) gehören, die ein grundlegendes DNA-Bindungsmotiv, eine Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne und Domänen zur Transaktivierung enthalten. Arabidopsis kodiert für 67 bZIP-Proteine, von denen man annimmt, dass sie alle als Homo- und/oder Heterodimere funktionieren (Deppmann et al., 2004). Einige dieser Proteine sind sehr klein und haben möglicherweise keine Aktivierungsdomänen. In einem klassischen Beispiel bei Pflanzen haben Fukazawa et al. (2000) die Funktion der bZIP TF REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) bei der Gibberellin-Signalgebung durch die Verwendung einer DN-Form von RSG aufgeklärt, der eine Transkriptionsaktivierungsdomäne fehlte und die daher die Funktion des Wildtyp-Proteins unterdrückte, wenn sie in transgenem Tabak exprimiert wurde. Wie bereits im Abschnitt über trans-DNs durch Überexpression erwähnt, sind DNA-Protein-Transkriptionskomplexe auch empfindlich gegenüber dem Gleichgewicht der Gendosierung (Birchler et al., 2001; Veitia, 2002). Veränderungen dieses Gleichgewichts durch verringerte oder erhöhte Expression eines TF im Verhältnis zu anderen, die an demselben Komplex beteiligt sind, können anormale Phänotypen hervorrufen.

Ein einfaches Modell der Transkriptionsaktivierung kann verwendet werden, um einige quantitative Feinheiten von DN-Mutationen in diesem Zusammenhang zu untersuchen. Studien an viralen Systemen und Drosophila haben gezeigt, dass die Transkription häufig eine sigmoidale Beziehung zur Konzentration eines TF aufweist. Im Falle eines Systems, das auf einen einzigen Aktivatortyp (A) reagiert, kann diese sigmoidale Reaktion in zwei Hauptkomponenten zerlegt werden: kooperative Bindung von A an den Promotor (p) eines Zielgens und Synergie (Abbildung 6). Die Synergie ist das Ergebnis der konzertierten Wechselwirkungen zwischen den Molekülen von A, die bereits an den Promotor gebunden sind, und der Transkriptionsmaschinerie (Carey, 1998; Veitia, 2003).

Betrachten wir einen Promotor p, der zwei Bindungsstellen für A enthält. Die gleichen Bindungsstellen werden auch von der Variante a erkannt, die als kompetitiver Inhibitor wirken könnte. Wir gehen davon aus, dass es bei der Interaktion zwischen A-Molekülen und dem Promotor eine Kooperativität geben kann. Dies könnte auch für die Wechselwirkungen zwischen A, a und dem Promotor zutreffen. Eine mögliche Quelle für die Kooperativität wurde bereits erwähnt (d. h. A neigt in Lösung zur Bildung von Dimeren, was jedoch während der DNA-Bindung verstärkt wird). Eine andere Möglichkeit ist, dass die Monomere in Lösung nicht interagieren können und dass die Interaktion eines Monomers mit der DNA zu einer allosterischen Veränderung führt, die die Affinität des gebundenen A für ein ankommendes Monomer erhöht. Es ist auch möglich, wenn auch weniger wahrscheinlich, dass es keine A-A-Wechselwirkungen gibt und dass die Bindung eines Monomers an die DNA zu einer Veränderung der benachbarten Stelle führt, die ihre Affinität für ein neu hinzukommendes Monomer erhöht. In jedem Fall bedeutet Kooperativität, dass die Reaktion pA + A = pAA leichter abläuft als p + A = pA.

Aufgrund der Synergie ist die Molekülspezies, die am meisten zur Transkription beiträgt, der von zwei Molekülen des Aktivators besetzte Promotor: pAA. Das bedeutet auch, dass, wenn die Affinitätskonstante für die Assoziation zwischen dem Komplex pA und der Polymerase KpolA ist, das K für die Assoziation von pAA und der Polymerase viel höher als 2K sein wird (in der Größenordnung von K2polA; siehe Zlotnick, 1994). Um die partielle Transaktivierungsaktivität in diesem Modell zu berücksichtigen, werden wir Kpola (für die Reaktion pa + pol) und Kpola2 (für paa + pol) verwenden. Unter diesen Annahmen kann eine Gleichung für die Transkriptionsantwort (TR) als Funktion der Konzentration von A (und a) abgeleitet werden, wie sie von Veitia (2003) und Veitia und Nijhout (2006) beschrieben wurde (siehe ergänzende Materialien online).

Mit dieser recht einfachen Gleichung können mehrere Bedingungen untersucht werden: (1) die Wildtyp-Situation A/A, (2) wenn ein Allel fehlt (A/-), und (3) wenn es eine Koexpression von A und einer verkürzten Version a gibt, der die Transaktivierungsdomäne fehlt. Im letzteren Fall können wir zwei verschiedene Situationen unterscheiden: (3a) wenn die Mutation von a die Kooperativität aufhebt oder (3b) wenn A und a kooperativ zusammenwirken. Schließlich können wir auch eine Situation (4) untersuchen, in der die Transaktivierungskapazität von a normal und die Kooperativität nicht vorhanden ist, und (5), in der die Kooperativität normal, die Transaktivierungskapazität aber nur teilweise vorhanden ist.

Abbildung 7 zeigt, dass a TR im Verhältnis zum maximalen Output des Promotors eine sigmoidale Beziehung aufweist, die zwischen 0 und 1 liegt. Die Sättigung spiegelt die maximale Reaktion des Systems wider, was jedoch nicht bedeutet, dass der Promotor nur bei Sättigung funktioniert. Der Abbildung zufolge sind die Werte auf der Kurve für den Heterozygoten A/- an jedem Punkt niedriger als bei A/A (für jeden relativen Wert hat der Heterozygote A/- in absoluten Zahlen zwei Mal weniger als der Wildtyp). Interessanterweise ist die Verschiebung zwischen den Kurven bei niedrigen relativen Konzentrationen von A sehr ausgeprägt Y(A/-) beträgt ∼25 % von Y(A/A). Wie intuitiv erwartet, wird jedoch bei hohen Werten von A auch in A/- eine Sättigung erreicht. Wäre dieses System bei niedrigen Konzentrationen von A normal funktionsfähig, würde ein Individuum A/- einen typischen haploinsuffizienten Phänotyp aufweisen.

Was passiert in A/a, wenn a die Transaktivierungsdomäne bei fehlender Kooperativität fehlt? Nach der klassischen DN-Definition ist die Kurve an jedem Punkt niedriger als die von A/-. Es besteht jedoch die Tendenz, mit zunehmender Konzentration von A und a eine Sättigung zu erreichen. Tatsächlich neigt A dazu, den Promotor bevorzugt zu besetzen, da es kooperative Wechselwirkungen mit ankommenden A-Monomeren sicherstellt. Es ist jedoch offensichtlich, dass die Erkennung des Promotors bei niedriger Proteinkonzentration in A/a weniger leicht erfolgt als im Wildtypzustand. In der Praxis führt ein verkürztes Monomer, das nicht in der Lage ist, kooperative Wechselwirkungen sicherzustellen, zu einer schwachen DNE. Ganz anders ist die Situation im anderen Extremfall, wenn die Kooperativität zwischen A und a vollständig erhalten bleibt. In der Tat wird das Plateau der Kurve für A/a bei TR = 0,25 erreicht. Dies ist zu erwarten, da pAA, das die Transkription antreibt (d. h. die Beiträge von pAa und paa sind vernachlässigbar), bei Sättigung nur 25 % der besetzten Promotorspezies ausmacht.

Ein mögliches Beispiel liefert eine künstliche Mutation in der TF FOXL2. Dieser TF unterdrückt den Promotor des menschlichen steroidogenen akuten regulatorischen Gens, das mehrere mutmaßliche Bindungsstellen enthält. Eine Version von FOXL2, die die DNA-Bindungsdomäne enthält, der aber die C-terminale Domäne fehlt, ist in der Lage, eine DNE zu induzieren, die die transkriptionelle Repression beeinträchtigt. Dieser Effekt tritt jedoch nur auf, wenn die DN-Version viel stärker exprimiert wird (5× und 10×) als das Wildtyp-Protein (Pisarska et al., 2004). Wie oben beschrieben, könnte dies auf das Fehlen kooperativer Interaktionen zwischen FOXL2-Molekülen an diesem Promotor zurückzuführen sein.

Ein aussagekräftigeres Beispiel ist in Abbildung 8 dargestellt, die die Reaktion von zwei verschiedenen Promotoren zeigt, die eine oder zwei Bindungsstellen für den TF PTX2a und seine DN-Version enthalten, wie zuvor beschrieben (Saadi et al., 2003. Bei geringen Mengen transfizierender DNA (0,05 μg in Abbildung 8) ist die Reaktion des Promotors mit zwei Bindungsstellen mehr als doppelt so stark (d. h. 3×) wie die Reaktion des Promotors mit nur einer Stelle. Dies ist die kombinierte Signatur von Kooperativität und Synergie. Darüber hinaus beträgt bei hohen Konzentrationen der transfizierenden Konstrukte WT+DN die TR des Promotors mit zwei Bindungsstellen ∼25 % der Reaktion des Wildtyps allein. Dies ist zu erwarten, da bei hoher Proteinkonzentration Dimere bereits vor dem Erreichen der Ziel-DNA vormontiert werden können. In diesem Fall werden nur 25 % der Dimere normal sein. Für den Promotor mit nur einer Bindungsstelle ist der Rückgang der TR weniger dramatisch (erwartete 50 %). Um zu vermeiden, dass ein potenzieller DNE in In-vitro-Experimenten übersehen wird, sollten geringe Mengen der WT+DN-Konstrukte mit einem Überschuss an Reporterpromotor transfiziert werden, um dessen Sättigung durch die Wildtyp-Form zu vermeiden. Generell sollten für solche Transfektionsexperimente Reaktionskurven für verschiedene TF-Konzentrationen erstellt werden.

Wie intuitiv erwartet, tritt bei normaler Transaktivierungskapazität von a und fehlender Kooperativität eine sehr milde DNE auf, die im heterozygoten Zustand zu einem Verhalten nahe einem Null-Allel führt. Die Isolierung dieser Art von Mutanten ist mit Hilfe eines eleganten genetischen Hefescreens möglich, der von Burz und Hanes (2001) beschrieben wurde. Eine Mutation kann den Grad der Kooperativität weniger dramatisch beeinflussen. Ein interessanter Fall tritt ein, wenn die Kooperativität auf etwa ein Zehntel des normalen Niveaus sinkt (gemäß den Parametern, die den in Abbildung 7 dargestellten Ergebnissen zugrunde liegen) und die Transaktivierungskapazität normal ist. Unter diesen Bedingungen verhält sich die Variante a im homozygoten a/a wie ein hypomorphes Allel und in A/a wie ein Null-Allel (d. h. A/a = A/-; Daten nicht gezeigt). Dies unterstreicht erneut das Fehlen eindeutiger Grenzen zwischen hypomorphen, DN- und Null-Allelen.

Wenn es eine restliche Transaktivierung gibt (d. h. 1<Kpola<KpolA) und die Kooperativität normal ist, wird das Plateau in A/a nicht bei TR = 1 erreicht, sondern auf einem niedrigeren Niveau. Allele mit teilweiser Aktivierungsfähigkeit können in einigen Fällen leicht hergestellt werden. Ein Beispiel dafür ist die Hefe-TF Gal4, die zwei aktivierende Regionen (ARI und ARII) enthält, die an der Rekrutierung der Transkriptionsmaschinerie beteiligt sind. Deletionen in der sauren Region ARII führen zu einer Abnahme der Transaktivierungskapazität (Ptashne und Gann, 2002; Ptashne, 2007). Eine Kombination eines solchen Allels mit dem Wildtyp-Gal4 sollte sich wie beschrieben verhalten. Wie in Abbildung 7 dargestellt, kreuzt die Kurve für A/a die von A/-. Das gleiche Allel kann also hypomorph sein, wenn das System bei niedrigen Sättigungsgraden funktioniert (bevor sich die Kurven schneiden), und kann bei höheren Proteinkonzentrationen molekular gesehen DN sein. Hierfür gibt es eine intuitive Erklärung. Nehmen wir zum Beispiel ein Protein a, das mit der Polymerase mit etwa 90 % der Stärke des Wildtyps interagiert. Für eine Reihe von Konzentrationen wird sich die Heterozygote A/a tendenziell wie A/A verhalten. Bei Sättigung werden jedoch nur 25 % der Promotorspezies pAA sein, das mit der Polymerase mit maximaler Stärke wechselwirkt. Im Gegensatz dazu ist es bei der Heterozygote A/- bei niedrigen Proteinkonzentrationen schwieriger, den Promotor zu besetzen, während bei Sättigung 100 % der Promotorspezies pAA sein werden. Die Kurven für A/a und A/- müssen sich also irgendwann schneiden.

Nicht alle Zielpromotoren innerhalb einer Zelle sind gleich empfindlich gegenüber einem DN TF. Bei starker Kooperativität und Synergie sollte die Empfindlichkeit eines Promotors gegenüber einem DN-Protein von der Anzahl der Bindungsstellen auf der DNA abhängen. Wenn die Promotorart, die die Transkription antreibt, vollständig mit Wildtyp-Protein beladen ist, wie oben angenommen, kann der maximale TR mit der Formel (der binomischen Wahrscheinlichkeiten) berechnet werden, die in den ergänzenden Materialien online angegeben ist. Für einen Promotor mit zwei identischen Bindungsstellen beträgt die maximale TR 25 % in Bezug auf die Wildtyp-Bedingung: für drei Bindungsstellen 12,5 % und für vier Bindungsstellen 6,25 % (wenn A und a in äquimolaren Konzentrationen exprimiert werden). Für komplexere Situationen ist die Antwort nicht intuitiv und erfordert die Analyse von Modellen, auf die hier nicht eingegangen wird.