Comparando quantidade e qualidade de DNA usando coleta de saliva após o consumo de alimentos e bebidas

Materiais e métodos

Obtivemos aprovação do conselho de revisão institucional de proteção a sujeitos humanos do Laboratório de Pesquisa da Força Aérea, protocolo número FWR20180101H. Os sujeitos foram informados individualmente e assinaram documentos de consentimento testemunhados por terceiros. Foram coletadas amostras de cinco sujeitos usando o Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab (Epicentre, Madison, WI) e o Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit (Isohelix, Kent, UK). Todas as amostras coletadas foram coletadas no mesmo dia com pelo menos 30 minutos entre cada coleta ou no decorrer de 3 dias, devido a restrições de tempo dos participantes. Foram recolhidas duas amostras por sujeito; cada esfregaço foi esfregado no interior de cada bochecha durante 10-15 s. Foram recolhidas seis amostras de saliva: por instruções do fabricante, imediatamente após tomar um copo de água, almoçar, beber um refrigerante gasoso, beber uma bebida desportiva, ou beber café.

As amostras foram extraídas utilizando o Epicentro QuickExtract™ Solução de Extracção de ADN 1.0 (Epicentro). O primeiro esfregaço foi processado como está e o segundo foi purificado usando o Sistema de Purificação de DNA Genômico SV (Promega, Madison, WI) usando o protocolo de microcentrífuga para a purificação do DNA genômico dos lisados de células de cultura de tecidos. Não houve etapa de lavagem celular porque as amostras já estavam em solução. As amostras de saliva foram extraídas utilizando o QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) com o protocolo de extracção de saliva modificado do fabricante.

As amostras foram quantificadas utilizando o NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e o Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) com o Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. O NanoDrop também foi utilizado para avaliar a pureza das amostras, comparando os valores de absorvância a 260 e 280 nm (A260/A280). Ambos foram utilizados por protocolos do fabricante. As amostras extraídas, normalizadas a 10 ng/μL com base nas concentrações de Qubit, foram analisadas utilizando um Gel de Agarose Precast E-Gel® a 2% (Thermo Fisher Scientific). O Bioanalisador Agilent (Agilent, Santa Clara, CA) juntamente com o Chip de DNA de Alta Sensibilidade foi utilizado para determinar a qualidade do DNA extraído.

As amostras foram então analisadas no Sistema de PCR Aplicado Biosystems™ 7500 Fast Real-Time (Applied Biosystems, Foster City, CA) para testar dois marcadores genéticos ligados às alergias aos amendoins: rs7192 e rs9275596 . Genotipagem com ajuste de reacção em cadeia de pré-polimerase em rampa rápida (PCR) de 60 °C durante 1 min, um ciclo de retenção de 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de 95 °C durante 15 s e depois 60 °C durante 1 min, e um pós-PCR a 60 °C durante 1 min. Foi utilizado TaqPath ProAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Os ensaios de polimorfismo de nucleotídeos simples (SNP) foram utilizados com metade da concentração recomendada pelo fabricante. O volume final foi de 10 µL.

Resultados

O método de extracção do esfregaço utilizando a solução QuickExtract resultou numa grande quantidade de ADN. Os valores de ADN obtidos do esfregaço sem qualquer outro processamento variaram de 1,38 a 54,2 pg/µL, conforme determinado pelo Bioanalisador (Ficheiro adicional 1: Tabela S1). Entretanto, resultados anteriores não relatados de nosso laboratório demonstraram que experimentos de sequenciamento foram inibidos quando bibliotecas foram preparadas diretamente a partir das extrações da solução QuickExtract. Portanto, purificamos essas amostras usando um protocolo de purificação de coluna Wizard, diminuindo a concentração, como esperado (variando de 2,59 a 38,2 pg/µL), e melhorando as proporções A260/A280 para mais próximo do intervalo geralmente aceito (1,8-2,1).

Amostras de Spit coletadas por protocolo do fabricante e extraídas usando o QIAamp Blood DNA Kit tinham um intervalo de 1,01 ng/μL a 8,20 ng/μL. A pureza indicada pela medição A260/A280 estava normalmente no intervalo para o ADN (ver Ficheiro Adicional 1: Tabela S1). Nenhuma das amostras de saliva coletadas após os sujeitos terem bebido várias bebidas ou almoçado mostrou concentrações de DNA e leituras de pureza significativamente diferentes daquelas coletadas usando o protocolo do fabricante (30 min de jejum) (Fig. 1).

Amostras extraídas normalizadas a 10 ng/μL como determinado por Qubit 4.0 leituras foram executadas em um E-Gel 2% usando uma escada de 1 kb (Arquivo adicional 1: Figura S1). Esperávamos ver uma faixa em direção ao topo do gel representando uma extração de DNA de alto peso molecular. Como esperado, o DNA extraído dos vários métodos de coleta de saliva era de alto peso molecular. Apesar de ser normalizado para uma entrada de 10-ng/µL, a maioria das amostras de swab não resultou em uma banda clara, sugerindo ou a presença de interferentes de carga ou algum outro problema sistemático.

Análise mais detalhada de tamanho e pureza em um Bioanalisador mostrou todas as amostras e todas as condições para ter predominantemente DNA de alto peso molecular e concentrações similares (Fig. 2). Além da baixa concentração acima mencionada após a purificação da extração do swab, não há tendências relacionadas à condição de coleta (comer ou beber) na qualidade, tamanho ou concentração do DNA que se tornam aparentes ao analisar os sinais do eletroferograma. Parece haver uma mudança dependente do assunto, embora este fenômeno não tenha sido mais perseguido.

Finalmente, usamos o genotipagem SNP para testar a adequação do DNA extraído para processos moleculares a jusante (Fig. 3). Todas as amostras extraídas de todos os sujeitos foram capazes de produzir com sucesso resultados utilizáveis para genotipagem de dois SNPs associados a alergias a amendoins, com exceção de uma das amostras de esfregaço purificado (sujeito 5B).

Discussão

Ao projetar um estudo de pesquisa genética, produto comercial, ou intervenção de saúde, usabilidade e conformidade do usuário final são duas considerações críticas. Os dispositivos de coleta de sangue que requerem punções cutâneas podem ter uma complacência menor devido à aversão à dor. A partir de observações em nosso laboratório, notamos anedotamente uma diminuição na taxa de inscrição em estudos quando a principal diferença é a amostragem de punção venosa vs. saliva. Não realizamos um estudo controlado para investigar este fenômeno; ao contrário, optamos por prosseguir com a amostragem de saliva com base na facilidade de uso, aparente aumento da taxa de inscrição e o tipo de estudos de pesquisa predominantemente realizados em nosso laboratório. Como nossos estudos envolvem a auto-administração da amostra de saliva, procuramos determinar se existe uma quantidade e qualidade suficiente de DNA presente para uso em aplicações moleculares downstream, seguindo várias condições prováveis de coleta de campo, principalmente a ingestão de diferentes alimentos e bebidas. O desenho do estudo não foi concebido para comparação cruzada entre indivíduos, mas sim para comparar a variabilidade intra-subjetivo da coleta de amostras. Com esse objetivo em mente, não observamos diminuição significativa nas quantidades de DNA causada pela variação das instruções do fabricante para jejum de 30 min antes da coleta.

Embora a quantidade de DNA seja importante, mais crítica para técnicas avançadas de biologia molecular é a qualidade do DNA obtido. Em nosso estudo, descobrimos que a coleta de amostras de saliva após comer e beber não teve impacto no rendimento de DNA de alto peso molecular. Tal DNA é crítico para o sequenciamento da próxima geração, varredura de matriz e genotipagem PCR. Além disso, um teste experimental usando dois alvos genéticos independentes na genotipagem PCR demonstrou que estas amostras eram passíveis de análise molecular.

O nosso objectivo com este estudo foi ver se a qualidade e quantidade do ADN da recolha de saliva por um kit de recolha de ADN de saliva seria afectada por não seguir as instruções do fabricante, isto é, beber ou comer mesmo antes da recolha. Consistente com a nossa hipótese, não vimos diferença na quantidade ou qualidade do DNA isolado.

Conclusão

Estudos genéticos se estenderam além do âmbito de um esforço puramente científico e agora são comuns entre o público consumidor. Para otimizar amostras humanas para estes estudos, os fabricantes estão se esforçando para desenvolver métodos de coleta simples e robustos. A amostragem de saliva é a menos invasiva destes métodos, produz ADN de alta qualidade e proporciona uma excelente estabilidade do produto. Nosso estudo do DNA obtido da saliva após o consumo de várias bebidas e/ou lanches mostrou que não há diferença significativa na quantidade e qualidade do DNA coletado usando o Kit de Coleta de DNA de Saliva Isohelix GeneFiX (Isohelix) quando as amostras não são coletadas por protocolo do fabricante. Embora o tamanho da amostra neste estudo seja pequeno, as observações de outros estudos em nosso laboratório são consistentes com os resultados de nossa comparação sistemática aqui apresentados. Portanto, concluímos que a coleta de saliva é uma forma robusta e não invasiva de coletar amostras tanto no laboratório quanto no campo, e a exigência de 30 minutos de abstinência de alimentos e bebidas é um ideal e não um absoluto.