Os componentes de um sistema básico de cromatografia líquida de alto desempenho são mostrados no diagrama simples na Figura E.
Um reservatório contém o solvente . Uma bomba de alta pressão é usada para gerar e medir uma vazão específica de fase móvel, tipicamente mililitros por minuto. Um injetor é capaz de introduzir a amostra no fluxo de fase móvel de fluxo contínuo que transporta a amostra para a coluna de HPLC. A coluna contém o material de embalagem cromatográfica necessário para efetuar a separação. Este material de embalagem é chamado de fase estacionária porque é mantido no lugar pelo hardware da coluna. Um detector é necessário para ver as bandas compostas separadas à medida que elas eluem da coluna de HPLC . A fase móvel sai do detector e pode ser enviada para o lixo, ou recolhida, conforme desejado. Quando a fase móvel contém uma banda composta separada, o HPLC fornece a capacidade de recolher esta fração do eluato contendo aquele composto purificado para estudo posterior. Isto é chamado cromatografia preparativa .
Note que tubos e conexões de alta pressão são usados para interconectar a bomba, injetor, coluna e componentes do detector para formar o conduto para a fase móvel, amostra, e bandas compostas separadas.
Figure E: High-Performance Liquid Chromatography System
O detector é ligado à estação de dados do computador, o componente do sistema HPLC que registra o sinal elétrico necessário para gerar o cromatograma em seu display e para identificar e quantificar a concentração dos componentes da amostra (ver Figura F). Como as características dos componentes da amostra podem ser muito diferentes, vários tipos de detectores foram desenvolvidos. Por exemplo, se um composto pode absorver luz ultravioleta, é utilizado um detector de absorção de UV. Se o composto fluorescer, é usado um detector de fluorescência. Se o composto não tiver nenhuma destas características, é usado um tipo de detector mais universal, como um detector de dispersão de luz evaporativa. A abordagem mais poderosa é a utilização de múltiplos detectores em série. Por exemplo, um detector UV e/ou ELSD pode ser usado em combinação com um espectrômetro de massa para analisar os resultados da separação cromatográfica. Isto fornece, a partir de uma única injeção, informações mais abrangentes sobre um analito. A prática de acoplar um espectrômetro de massa a um sistema HPLC é chamada LC/MS.
Figure F: A Typical HPLC System
HPLC Operation
Uma maneira simples de entender como conseguimos a separação dos compostos contidos em uma amostra é visualizar o diagrama na Figura G.
Fase móvel entra na coluna pela esquerda, passa através do leito de partículas e sai pela direita. A direção do fluxo é representada por setas verdes. Primeiro, considere a imagem superior; ela representa a coluna no tempo zero , quando a amostra entra na coluna e começa a formar uma banda. A amostra mostrada aqui, uma mistura de corantes amarelos, vermelhos e azuis, aparece na entrada da coluna como uma única faixa preta.
Após alguns minutos, durante os quais a fase móvel flui de forma contínua e constante para além das partículas do material de embalagem, podemos ver que os corantes individuais se moveram em bandas separadas a velocidades diferentes. Isto porque existe uma competição entre a fase móvel e a fase estacionária para atrair cada um dos corantes ou analitos. Note que a faixa de corante amarelo se move mais rapidamente e está prestes a sair da coluna. O corante amarelo gosta mais da fase móvel do que das outras tinturas. Portanto, ele se move a uma velocidade mais rápida, mais próxima à da fase móvel. A faixa de corante azul gosta mais do material de embalagem do que da fase móvel. A sua atracção mais forte pelas partículas faz com que se mova significativamente mais devagar. Em outras palavras, é o composto mais retido nesta mistura de amostras. A faixa de corante vermelho tem uma atração intermediária para a fase móvel e, portanto, move-se a uma velocidade intermediária através da coluna. Como cada faixa de tintura se move a velocidades diferentes, podemos separá-la cromatograficamente.
Figure G: Understanding How a Chromatographic Column Works – Bands
What Is a Detector?
As faixas de tintura separadas saem da coluna, elas passam imediatamente para o detector. O detector contém uma célula de fluxo que vê cada banda composta separada contra um fundo de fase móvel . Um detector apropriado tem a capacidade de detectar a presença de um composto e enviar o seu sinal elétrico correspondente para uma estação de dados do computador. Uma escolha é feita entre muitos tipos diferentes de detectores, dependendo das características e concentrações dos compostos que precisam ser separados e analisados, como discutido anteriormente.
O que é um cromatograma?
Um cromatograma é uma representação da separação que ocorreu quimicamente no sistema HPLC. Uma série de picos ascendentes a partir de uma linha de base é desenhada em um eixo temporal. Cada pico representa a resposta do detector para um composto diferente. O cromatograma é traçado pela estação de dados do computador .
Figure H: How Peaks Are Created
Na Figura H, a banda amarela passou completamente pela célula de fluxo do detector; o sinal elétrico gerado foi enviado para a estação de dados do computador. O cromatograma resultante começou a aparecer na tela. Note que o cromatograma começa quando a amostra foi injetada pela primeira vez e começa como uma linha reta definida perto da parte inferior da tela. Isto é chamado de linha de base; representa a fase móvel pura que passa através da célula de fluxo ao longo do tempo. Quando a banda amarela do analito passa pela célula de fluxo, um sinal mais forte é enviado para o computador. A linha curva, primeiro para cima, e depois para baixo, em proporção à concentração do corante amarelo na banda de amostra. Isto cria um pico no cromatograma. Depois que a banda amarela passa completamente fora da célula detectora, o nível de sinal retorna à linha de base; a célula de fluxo agora tem, mais uma vez, apenas a fase móvel pura dentro dela. Como a banda amarela se move mais rápido, eluindo primeiro da coluna, é o primeiro pico desenhado.
Um pouco depois, a banda vermelha atinge a célula de fluxo. O sinal sobe da linha de base quando a banda vermelha entra primeiro na célula, e o pico que representa a banda vermelha começa a ser desenhado. Neste diagrama, a banda vermelha ainda não passou completamente pela célula de fluxo. O diagrama mostra como seria a banda vermelha e o pico vermelho se parássemos o processo neste momento. Como a maior parte da banda vermelha já passou pela célula, a maior parte do pico foi desenhada, como mostra a linha sólida. Se pudéssemos reiniciar, a banda vermelha passaria completamente através da célula de fluxo e o pico vermelho seria completado. A faixa azul, a mais fortemente retida, viaja na velocidade mais lenta e se alonga após a faixa vermelha. A linha pontilhada mostra como o cromatograma completo apareceria se tivéssemos deixado a corrida continuar até a sua conclusão. É interessante notar que a largura do pico azul será a mais larga porque a largura da banda azul do analito, embora mais estreita na coluna, torna-se a mais larga à medida que se elui da coluna. Isto porque ele se move mais lentamente através do leito do material de embalagem cromatográfico e requer mais tempo para ser eluido completamente. Como a fase móvel flui continuamente a uma velocidade fixa, isto significa que a banda azul se alarga e é mais diluída. Como o detector responde em proporção à concentração da banda, o pico azul é menor em altura, mas maior em largura.