Primeiro passo sobre os fundamentos da citometria de fluxo
O que é a citometria de fluxo?
Citometria de fluxo é uma técnica utilizada para detectar e medir características físicas e químicas de uma população de células ou partículas. Neste processo, uma amostra contendo células ou partículas é suspensa em um fluido e injetada no instrumento do citômetro de fluxo.
Qual é a finalidade da citometria de fluxo?
Citometria de fluxo fornece um método bem estabelecido para identificar células em solução e é mais comumente usada para avaliar sangue periférico, medula óssea e outros fluidos corporais. Os estudos de citometria de fluxo são usados para identificar e quantificar células imunes e caracterizar malignidades hematológicas.1 Eles podem medir:
- tamanho de célula
- granularidade de célula
- DNA total
- novo sintetizado
- expressão do gene do ADN
- receptores de superfície
- intracelular proteínas
- sinal de transparência
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A capacidade de realizar estas medições num período de tempo muito rápido é uma das principais vantagens do processo citométrico de fluxo. Eles podem quantificar até três a seis propriedades ou componentes numa única amostra, célula por célula, por cerca de 10.000 células, em menos de um minuto.
Citometria de fluxo Instrumentação e Metodologia
Citômetros de fluxo absorvem uma suspensão de células monodispersas simples, não agrupadas e passam uma de cada vez (arquivo único) por um feixe laser, onde cada célula passa através do feixe laser, luz dispersa e fluorescente e são então contadas e classificadas ou ainda caracterizadas.
Os três componentes principais de um citômetro de fluxo são os fluídicos, ópticos e eletrônicos.
- O sistema fluídico de um citômetro de fluxo é responsável por transportar amostras do tubo de amostra para a célula de fluxo, passando pelo laser, classificadas e/ou descartadas.
- Os componentes do sistema óptico incluem fontes de luz de excitação, lentes e filtros ópticos usados para coletar e mover comprimentos de onda de luz ao redor do instrumento e o sistema de detecção que gera a fotocorrente. A diferença de resposta do comprimento de onda nos dados ajuda a analisar o tipo de célula.
- A instrumentação eletrônica ou do citômetro de fluxo.
Um dos princípios principais do uso da citometria de fluxo é a capacidade de analisar o ciclo celular completo e analisar o conteúdo de DNA em diferentes fases. A monitorização dos eventos naturais do ciclo celular pode fornecer informações para o diagnóstico da doença e o prognóstico da terapia. As diferentes fases do ciclo celular podem revelar conteúdo de DNA alterado e outras anomalias indicadas pela presença de tumores ou sinais de morte celular avançada. As expressões de dados são armazenadas em um computador através de um software especializado de citometria de fluxo associado ao uso do instrumento escolhido durante o tempo de análise. Os dados da citometria de fluxo são normalmente relatados de duas formas distintas: um histograma e/ou um gráfico de pontos2.
| G1 fase: | RNA, ribossomos e proteínas são sintetizados |
| S fase: | DNA é replicado |
| G2 fase: | Representa a fase entre a síntese de DNA e a mitose |
| M fase: | Células são divididas em duas células filhas |
FACS
Fluorescência-activated cell sorting (FACS) é um tipo especializado de citometria de fluxo. Ela fornece um método para classificar uma mistura heterogênea de células biológicas em dois ou mais recipientes, uma célula de cada vez, com base nas características específicas de dispersão de luz e fluorescência de cada célula. É diferente da citometria de fluxo na medida em que proporciona uma caracterização única versus a simples contagem e triagem de células. É comum que os dois princípios trabalhem em um processo do tipo co-caracterização para oferecer uma abordagem qualitativa e quantitativa completa da análise citométrica de fluxo.
O processo citométrico de fluxo:
A suspensão celular é colocada no centro de um fluxo de líquido estreito e de fluxo rápido. O fluxo é organizado de forma que haja uma grande separação entre as células em relação ao seu diâmetro. Um mecanismo vibratório força o fluxo de células a quebrar em gotículas individuais. O sistema é ajustado para que haja uma baixa probabilidade de mais de uma célula por gotícula. Pouco antes do fluxo quebrar em gotículas, o fluxo passa por uma estação de medição de fluorescência onde o caráter fluorescente de interesse de cada célula é medido.
Um anel de carga elétrica é colocado exatamente no ponto onde o fluxo se rompe em gotículas. Uma carga é colocada no anel com base na medição da intensidade de fluorescência imediatamente anterior, e a carga oposta é retida na gota à medida que esta se rompe do fluxo. As gotículas carregadas caem então através de um sistema de deflexão eletrostática que desvia as gotículas para recipientes com base na sua carga. Em alguns sistemas, a carga é aplicada diretamente no fluxo, e a gota que se rompe retém a carga do mesmo sinal que o fluxo. A corrente é então devolvida ao ponto neutro após a quebra da gota.
Um anticorpo específico para uma determinada proteína de superfície celular é associado a uma molécula fluorescente e depois adicionado a uma mistura de células. O passo seguinte é o processo de fluorescência, enquanto que células específicas passam por um feixe laser e são monitoradas. As gotículas contendo uma única célula recebem uma carga positiva ou negativa, com base no facto de a célula possuir um anticorpo com marcação fluorescente. As gotículas contendo uma única célula são então detectadas por um campo eléctrico e desviadas para tubos de recolha separados de acordo com a sua carga, permitindo uma fácil separação das células marcadas com o anticorpo fluorescente.
Citometria de fluxo multicolor
Citometria de fluxo multicolor é uma técnica útil ao examinar populações mistas de células, tais como sangue e células tecidulares em amostras humanas e animais. Geralmente, um tipo específico de célula é marcado com corante fluorescente (marcadores) como fluoróforo ou iodeto de propidio. A capacidade de usar múltiplos marcadores fluorescentes simultaneamente permite a identificação de múltiplos tipos de células, bem como marcadores funcionais que caracterizam ainda mais cada amostra. Existem instrumentos especializados capazes de medir mais de 12 cores 3,4 . Estes corantes e marcadores fluorescentes são medidos por diferentes comprimentos de onda de luz emitida pelo laser para classificar por tipo de célula individual. Cada marcador é excitado em um comprimento de onda de luz específico para diferenciá-los quando se usa múltiplos marcadores.
Adaptar um painel de coloração típico de 4 a 6 cores para mais de 12 cores não é simplesmente uma questão de “plug and play”, ele deve ser abordado de forma sistemática para atingir parâmetros de sucesso em um painel de coloração. Os princípios básicos do design do painel funcionam melhor com base na pesquisa pré-uso. Em outras palavras, a preparação é fundamental mesmo desde o início do processo de referência ao índice de coloração no que diz respeito à correspondência efetiva de fluorocromos pelo brilho5.
Dica de Citometria de Fluxo:
Diga em algum tempo para entender as nuances sutis do seu citómetro de fluxo antes de desenhar o seu painel primário de anticorpos. Concentre-se em onde as medidas mais sensíveis podem ser feitas no sistema. Há mais na história do que apenas intensidade fluorescente.
Considerar que substitui um fluorocromo menos brilhante para evitar erros de canal.
Aplicações comuns da metodologia de citometria de fluxo
Citometria de fluxo é um componente integral em várias áreas clínicas, incluindo diagnóstico, planos de tratamento e doença sistêmica, estática ou progressiva. À medida que aprendemos mais sobre as aplicações práticas para uso na citometria de fluxo, a base de conhecimento é ainda mais expandida. Agora, mais do que nunca, os pesquisadores estão muito entusiasmados em poder aprender mais sobre as complexidades de certas doenças e condições. Isso levou a uma rápida mudança no padrão de diagnóstico e alterou drasticamente as abordagens médicas para o tratamento de doenças como o câncer6.
A metodologia da citometria de fluxo está frequentemente envolvida com outros padrões de testes abrangentes, tais como o exame morfológico. Em muitos casos, as neoplasias hematológicas descrevem alterações morfológicas específicas, e a citometria de fluxo proporciona maior especificidade e ajuda os patologistas a expandir as anomalias dos tecidos ou outras doenças avançadas. A citometria de fluxo, em alguns casos, pode predeterminar a recorrência do câncer antes que as alterações morfológicas sejam detectadas7,
Uma pequena parte das principais aplicações utilizadas no âmbito dos ambientes clínicos modernos, tanto terapêuticos como orientados para a pesquisa, incluem:
- Expressão da proteína – através de toda a célula, mesmo o núcleo
- Modificações pós translacionais da proteína -inclui proteínas clivadas e fosforiladas
- RNA -incluindo ambos miRNA, e transcrições do mRNA
- Células apoptóticas ou morte celular
- Células em fase G0/G1 versus fase S, G2, ou poliploidia, incluindo análise de proliferação e ativação celular
- Identificação e caracterização de subconjuntos distintos de células dentro de uma amostra heterogênea – incluindo a distinção entre células de efeito central ou células T de memória exauridas ou células T reguladoras
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Brapar para cima
Os princípios básicos da citometria de fluxo mudaram pouco na última década, mas as aplicações desta tecnologia evoluíram muito. As bases da citometria de fluxo têm sido consistentes com sua função primária, que é interrogar células ou partículas individuais em um fluxo com um laser à medida que as células passam por um conjunto de detectores estacionários. Cada vez mais, mais cores de fluorescência estão sendo detectadas pelos citômetros, juntamente com a classificação de alta velocidade e função analítica8.
Citometria de fluxo desempenha um papel integral na pesquisa da ciência molecular e continua a evoluir a um ritmo rápido. Existem vários citômetros de fluxo comercial no mercado. Eles tendem a operar com o mesmo princípio básico, mas existem diferenças importantes em seu design e conceitos de alinhamento e integração de outros componentes.
Em breve no horizonte, um instrumento 3D será introduzido e incorporado num instrumento híbrido proprietário produzido pela NanoCellect Biomedical, a WOLF Cell Sorter. Também podemos aguardar o desenvolvimento de sondas fluorescentes de espectro estreito, a integração de técnicas biológicas moleculares com citometria de fluxo, e a avaliação de marcadores livres de células como citocinas serão componentes chave na evolução contínua da análise de citometria de fluxo e tecnologia de ensaio celular.
Fontes:
1 http://clinchem.aaccjnls.org/content/46/8/1221
2 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18615596-flow-cytometry-histograms-transformations-resolution-and-display/
3 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.20959
4 https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.26
5 https://www.nature.com/articles/nprot.2006.250
6 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19967915-immunophenotypic-analysis-of-bone-marrow-b-lymphocyte-precursors-hematogones-by-flow-cytometry/
7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4803461/
8 https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-150-0:543