The Berg Lab

Tato příručka je převzata z programu University of Arizona Department of Biochemistry and Molecular Biophysics General Biology Program for Science Teachers: Drosophila melanogaster and Mendelian Genetics, by Pete Geiger.

An Introduction to Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster je malá, běžná moucha, která se vyskytuje v blízkosti nezralého a shnilého ovoce. Již více než sto let se používá ke studiu genetiky a chování. Thomas Hunt Morgan byl na počátku 20. století předním biologem studujícím drozofilu. Jako první objevil pohlavní vazby a genetickou rekombinaci, čímž se malá muška dostala do popředí genetického výzkumu. Díky její malé velikosti, snadné kultivaci a krátké generační době genetici od té doby využívají drozofily.

Mouchy se snadno získávají z volné přírody a mnoho biologických vědeckých společností nese různé mutace. Tyto společnosti navíc prodávají veškeré vybavení potřebné ke kultivaci mušek. Náklady jsou relativně nízké a většinu vybavení lze používat rok co rok. Existuje celá řada laboratorních cvičení, která je možné zakoupit, i když nutnost tak učinit je sporná.

Proč používat drozofily?“

Učitelé by měli používat ovocné mušky pro genetické studie na středních školách z několika důvodů:
1. Drozofily jsou vhodné pro studium genetiky. Jsou malé a snadno se s nimi manipuluje.
2. Lze je snadno umrtvit a manipulovat s nimi individuálně pomocí nesložitých přístrojů.
3. Jsou pohlavně dimorfní (samci a samice se liší), takže je poměrně snadné rozlišit pohlaví.
4. Panenské ovocné mušky se fyzicky liší od dospělých jedinců, takže je snadné získat panenské samce a samice pro genetické křížení.
5. Dospělé mušky se liší od dospělých jedinců. Mouchy mají krátkou generační dobu (10-12 dní) a daří se jim dobře při pokojové teplotě.
6. Péče o ovocné mušky a jejich kultivace nevyžaduje mnoho vybavení, je finančně nenáročná a spotřebuje málo místa i pro velké kultury.

Pomocí drozofil se studenti:
1. Seznámí se se základními principy chovu ovocných mušek. Pochopí mendelovskou genetiku a dědičnost znaků
2. Ze získaných dat vyvodí závěry o zákonitostech dědičnosti
3. Zkonstruují pasti na odchyt volně žijících populací D. melanogaster
4. Získají představu o životním cyklu D. melanogaster, hmyzu, který vykazuje úplnou metamorfózu
5. Udělají si představu o životním cyklu D. melanogaster. Zkonstruovat křížence odchycených a známých mušek divokého typu a mušek zmutovaných
6. Naučit se techniky manipulace s muškami, jejich pohlaví a vedení stručných poznámek do deníku
7. Naučit se techniky kultivace pro udržení zdravých mušek
8. Uvědomit si, že mnoho přírodovědných experimentů nelze provést a uzavřít během jednoho nebo dvou laboratorních sezení

Národní standardy zahrnuté v těchto lekcích:
Obsah:
1. Uvědomit si, že mnoho přírodovědných experimentů nelze provést a uzavřít během jednoho nebo dvou laboratorních sezení. Organismy vyžadují soubor instrukcí pro specifikaci znaků (dědičnost)
2. Dědičná informace se nachází v genech.
3. Kombinace znaků mohou popisovat vlastnosti organismu.

Cíle žáků:
1. Dědičná informace se nachází v genech. Určit otázky a pojmy, kterými se řídí vědecké zkoumání
2. Navrhnout a provést vědecké zkoumání
3. Formulovat a revidovat vědecká vysvětlení a modely s využitím logiky a důkazů
4. Sdělit a obhájit vědecký argument

Genetika drozofily je dobře zdokumentována a na několika webových stránkách s veřejnou doménou je k dispozici kompletní anotovaný genom. Učitelé nebo studenti, kteří se chtějí podívat, kde se vyskytují jejich mutace, tak mají k dispozici pohotovou referenci.

Protože je drozofila v genetice tak široce využívána, je možné zakoupit mnoho různých typů mutací. Pozorný student navíc může najít mutace v rámci svých vlastních volně žijících kultur, protože vzhledem ke krátké generační době jsou mutace ve srovnání s jinými živočišnými druhy poměrně časté.
Klasifikace
Doména: Eukarya
Říše:
Fylum: Arthropoda
Třída: Hmyz (Insecta)
Řazení: Čeleď: Diptera
Člen: Drosophilidae
Rod: Drosophila („rosnička“)
Druh: melanogaster („tmavé střevo“)
Životní cyklus Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster vykazuje úplný metamorfismus, což znamená, že životní cyklus zahrnuje vajíčko, larvální (červovitou) formu, kuklu a nakonec vynoření (zatmění) jako létající dospělý jedinec. To je stejné jako u známé metamorfózy motýlů. Larvální stádium má tři instary neboli larvy.

Den 0: Samice klade vajíčka
Den 1: Vajíčka se líhnou
Den 2: První instar (délka jeden den)
Den 3: Druhý instar (délka jeden den)
Den 5: Třetí a poslední instar (délka dva dny)
Den 7: Larvy začínají putovní stádium. Puparizace (vznik kukly) nastává 120 hodin po nakladení vajíček
Den 11-12: Eklóza (dospělci se vynořují z kukelního pouzdra)

Samičky pohlavně dospívají 8-10 hodin po eklózi

– Generační doba Drosophila melanogaster se mění v závislosti na teplotě. Výše uvedený cyklus platí pro teplotu přibližně 22 °C. Mouchy chované při nižší teplotě (do 18 °C, tj. 64°F) se budou vyvíjet přibližně dvakrát déle.
– Samičky mohou naklást až 100 vajíček/den.
– Panenské samičky jsou schopny naklást vajíčka, budou však sterilní a bude jich málo.

Po vylíhnutí vajíček by měly být v kultivačním médiu viditelné malé larvy. Pokud je vaše médium bílé, hledejte malou černou oblast (ústní háčky) u hlavy larev. Některá sušená předem namíchaná média jsou modrá, aby pomohla identifikovat larvy, nicméně to není nutností a s trochou trpělivosti a praxe jsou larvy snadno vidět. Kromě toho larvy při krmení narušují hladký povrch média, a tak lze pouhým pohledem na povrch zjistit, zda jsou přítomny larvy. Vždy je však dobré provést dvojí kontrolu pomocí stereomikroskopu. Po třetím instaru začnou larvy migrovat nahoru po kultivační lahvičce, aby se zakuklily.

Péče, údržba a manipulace s drozofilami

Úvod
Pro zařazení ovocných mušek do výuky bude nutné udržovat kultury mušek pro manipulaci při křížení a jako zálohu pro případné nehody, ke kterým může dojít. Kultivace je velmi snadná a doporučuje se, aby si studenti udržovali vlastní kultury mušek. Tímto způsobem by byl každý student nebo skupina přímo zodpovědný za péči o mouchy a jejich dlouhodobé udržování, včetně vytváření velkých populací kultur pro jejich křížení. Při přímém zapojení získají studenti zručnost a lepší porozumění požadavkům a chování mušek. Učitel by měl zůstat v roli trenéra, nikoliv lektora, který studentům pomáhá s technikami. Vyučující musí udržovat zásobní kultury všech kmenů a mutantů používaných studenty pro případ, že by došlo k výše zmíněné nepředvídatelné události a studentské kultury by uhynuly nebo se smísily. Ztráta kultur je spíše výjimkou než pravidlem, a pokud studenti své mouchy pravidelně rekulturují a nedochází k hromadné kontaminaci, lze mouchy udržet po desítky let.
Lahve a zkumavky
Thomas Hunt Morgan používal pro své pokusy skleněné lahve od mléka a v podstatě se hodí jakákoli nádoba, včetně dětských skleniček a různých nádob. Pro snadnou kultivaci a přenos kultur jsou však nejlepší jednotné láhve a lahvičky. Obojí lze zakoupit v obchodě s biologickými potřebami. Lahve se používají hlavně pro udržování velkých populací much, zatímco kultivační lahvičky jsou užitečné pro udržování menších populací a jsou preferovanou nádobou pro konstrukci studentských kříženců. Pokud chcete udržovat zásobní kultury po delší dobu nebo opakovaně používat lahve a lahvičky, je důležité je zcela vyčistit a sterilizovat. Je to proto, aby se zabránilo propuknutí škůdců a chorob.

Chcete-li lahve a lahvičky vyčistit, nejprve je zmrazte, abyste v nich zabili všechny mouchy. Vyjměte z nich potraviny, dobře je umyjte a poté je sterilizujte autoklávováním (po dobu 20 minut při teplotě 121 °C a tlaku 15 psi; pokud jsou nádoby plastové, ujistěte se, že je lze sterilizovat v autoklávu) nebo umytím v 10% roztoku chlorového bělidla.

Lahve a lahvičky lze zakoupit v různých velikostech a z různých materiálů. Sklo je účinné, avšak v případě pádu by student mohl při jediném vylití ztratit 2 týdny dat. K dispozici jsou autoklávované (sterilní) plastové lahvičky, které jsou pro použití studenty vhodnější. Velikost lahviček se pohybuje od 96 × 25 mm až po větší rozměry, avšak pro provádění křížení a udržování malých kultur se doporučuje menší velikost. K dispozici je řada zátek od měkkých bavlněných až po pěnové. Je to otázka preferencí a nákladů, nicméně bavlna funguje dobře a v nouzi ji lze koupit v místní drogerii.
Kde nakoupit spotřební materiál:
Carolina Biological Supply Company
FlyStuff.com, A division of Genesee Scientific
Jak vypadají:

StereomikroskopLahvička s drozofilouLahvičky s drozofilou

Krmivo pro mouchy
Prvním krokem při přípravě kultivačních lahviček je přidání krmného média. Pro mouchy je k dispozici řada typů potravy; některé vyžadují vaření a jiné se kupují již připravené a dehydrované. Poslední jmenované lze zakoupit u společnosti dodávající biologické produkty. To je samozřejmě mnohem rychlejší a jednodušší než příprava vařených médií, a to natolik, že si studenti mohou naplnit zkumavky médii sami. Pro dosažení nejlepších výsledků však musí být zcela rehydratovaná, protože to je jediný zdroj vody pro dospělce a larvy. Proto se řiďte následujícími návrhy, abyste zajistili zcela hydratované médium:

Dehydratované médium
Doplňte suché médium do lahvičky nebo lahvičky přibližně do 1/5 až 2/5 objemu. Přidávejte vodu, dokud se médium nebude zdát zcela zvlhčené. Nechte lahvičku několik minut stát a v případě potřeby přidávejte další vodu, dokud není médium zcela hydratované. Povrch by měl být vlhký a lesklý a v médiu by neměly být žádné mezery. Pokud médium není zcela hydratováno, je ohrožena produkce vitálních kultur. Mouchy lze přidávat několik minut po hydrataci média. Nezapomeňte před přidáním mušek přidat na povrch média několik zrnek (ne však více) kvasinek.

Vařené médium
Při dávkování vařeného média by mělo naplnit kultivační lahvičku, lahvičku nebo lahvičku z 1/5 až 2/5. Při dávkování vařeného média by mělo být médium naplněno z jedné pětiny. Uchovávejte médium přes noc venku, aby se vytvrdilo, přičemž lahvičky přikryjte látkou, aby do nich divoké mouchy nenakladly vajíčka. Druhý den přidejte kvasinky a zátky. Nepoužité lahvičky s médiem uložte do chladničky. Připravená média lze skladovat v chladničce po dobu několika týdnů. Před přidáním mušek nechte média ohřát na pokojovou teplotu. Nedovolte, aby média vyschla.
Prostředí
Nejjednodušší způsob pěstování mušek je při pokojové teplotě. Optimální podmínky pro chov jsou však teplota 25 °C a 60% vlhkost vzduchu. Za těchto podmínek je generační doba kratší (9-10 dní od vajíčka po dospělce). Pokud není zařízení snadno dostupné, je to pro úspěšný chov a křížení mušek zbytečné. Je vhodnější držet mouchy mimo průvan a přímé sluneční světlo nebo zdroje tepla. Ty rychle vysušují média, což vyžaduje častou výměnu médií a potenciální dehydrataci mušek.
Anestezie mušek
Problémem ovocných mušek je, že létají! Proto byla vyvinuta řada metod anestetizace mušek. Patří sem éter, komerční značky, jako je Flynap, oxid uhličitý a chlazení. Každá z nich má své silné a slabé stránky. Éter je hořlavý, má silný zápach a při nadměrném omámení mouchy zabíjí (a může znecitlivit mladší žáky!). Flynap, od společnosti Carolina Biological, je nepořádný a má zápach, který někteří považují za urážlivý. Každý z nich však vyžaduje levné vybavení, které lze snadno zakoupit. Oxid uhličitý funguje velmi dobře, udržuje mouchy nehybné po dlouhou dobu bez vedlejších účinků, nicméně podložky (bloky) CO2 jsou drahé a je nutný zdroj CO2 (obvykle láhev) a dodávkový systém (lahvičky a svorky), což zvyšuje náklady. Pokud je člověk vynalézavý, může ke krátkodobému znecitlivění mušek použít CO2 uvolňovaný z tablet Alka-Seltzer. Připravte velkou zkumavku se systémem zkumavek a zátek. Do zkumavky přidejte vodu a poté tabletu Alka-Seltzer. Bude se uvolňovat plynný oxid uhličitý.

Nejméně škodlivý pro mouchy je buď oxid uhličitý, nebo chladicí anestetikum. Z těchto dvou možností je nejjednodušší chlazení, které vyžaduje pouze mrazák, led a Petriho misky. Navíc je to jediná metoda, která neovlivní neurologii mušek, a proto mohou studie chování začít až poté, co se mušky dostatečně zahřejí.
Anestetizace mušek chlazením
Pro znehybnění mušek umístěte kultivační lahvičku do mrazáku, dokud se mušky nehýbou, obvykle 8-12 minut. Vyklopte mouchy na vychlazený povrch. Tu lze vytvořit pomocí horní části Petriho misky, přidáním drceného ledu a následným položením dna Petriho misky na ni. Přidání mušek do tohoto systému je udrží v chladu dostatečně dlouho na provedení každého pokusu. Po skončení kultivace mušky jednoduše umístěte zpět do kultivační nádobky. Po vyjmutí z ledu se mouchy poměrně rychle „probudí“, proto je udržujte v chladu. Tato metoda nemá žádné dlouhodobé vedlejší účinky, i když mouchy ponechané v chladničce příliš dlouho se nemusí zotavit. Dalším způsobem, jak udržet mouchy v chladu, je přidat vodu do mrazicích sáčků typu zip-lock, vložit je do mrazáku s Petriho miskou položenou na sáčku a nechat zmrazit.
Přenášení much z jedné lahvičky do druhé
Mouchy by se měly přenášet každých 10 až 14 dní. Studenti by měli udržovat záložní kultury svých mušek a instruktor by měl udržovat záložní zásobní kultury všech kmenů mušek. Při vytváření nových kultur existují dva základní způsoby přenosu mušek. Jeden nevyžaduje žádné umrtvení, ale rychlé ruce.
A) Umístěte nálevku do ústí lahvičky s čerstvou kulturou, do které již bylo přidáno médium. Do staré lahvičky (té, ve které jsou mouchy) jemně poklepejte mouchy dolů měkkým tupováním lahvičky o měkký povrch, například o podložku pod myš. Mouchy spadnou na dno a zůstanou tam několik sekund (ne déle!), což je dost času na to, abyste rychle sundali zátku z lahvičky, obrátili ji do nálevky a jemně sešlápli obě lahvičky dohromady, aby se mouchy dostaly dolů do nové lahvičky.
B) Alternativním způsobem je vložit mouchy do mrazáku asi na 8 minut. To způsobí, že mouchy upadnou do stavu strnulosti. Po umístění nálevky na novou lahvičku obraťte lahvičku s nehybnými mouchami do nálevky. Není to tak zábavné, ale po třídě vám nebudou létat žádné mouchy.
Pohlavní mušky
Je poměrně snadné rozeznat samečky od samiček a s trochou cviku si studenti budou jistí, že to dokáží. Všimněte si, že samci jsou obecně menší a mají tmavší a zaoblenější bříško. Zbarvení břicha je nejsnáze rozpoznatelné. Kromě toho mají samci na prvním páru nohou tarzální pohlavní hřebínky. Jsou černé a velmi výrazné, ale lze je vidět pouze při poměrně velkém zvětšení. S trochou cviku se studenti při pohledu na břicho zdokonalí v přesném určování pohlaví mušek. Určování pohlaví mušek je při křížení velmi důležité, proto se ujistěte, že studenti s jistotou rozpoznají rozdíl mezi pohlavími. Aby se studenti cítili při určování pohlaví mušek dobře, dejte jim nebo je nechte získat 25 nebo více mušek smíšeného pohlaví a nechte je mušky roztřídit na dvě hromádky, samce a samice. Ostatní studenti ve skupině a instruktor by měli třídění ověřit. Každý člen skupiny by měl být schopen mušky pohlavně roztřídit.
Obrázky samců a samic

Všimněte si tmavšího břicha a zaoblenějšího vzhledu samce. Samice také bývají větší.
Sběr panenských samic
Přestože je umístění panenských samic k samcům jednoduchou záležitostí, je důležité si uvědomit časový faktor získávání panen. Samice zůstávají pannami pouze 8-10 hodin po uzavření a je třeba je v tomto časovém rozmezí sbírat. POZNÁMKA: Samice mají schopnost uchovávat sperma po jednom páření, takže pokud samice pro křížení není panna, nebudete znát genotyp samce použitého pro vaše křížení. Důrazně doporučujeme, abyste si opatřili další panny pro případ, že dojde k omylu při identifikaci nebo že moucha uhyne dříve, než dojde k páření a nakladení vajíček. V silné kultuře by mělo být možné snadno získat více panenských samic. Samičky jsou sice schopné klást vajíčka jako panny, ale budou sterilní a nebudou produkovat žádné larvy. Níže jsou uvedeny tři způsoby, jak získat panny, přičemž pro začátečníky je nejvhodnější „metoda odstranění“.
Metoda odstranění
Odstraňte všechny mouchy 8-10 hodin před sběrem (obvykle se to dělá hned ráno). Vizuálně zkontrolujte povrch potravy, abyste zajistili úplné odstranění much. Po 8-10 hodinách (obvykle před odchodem z práce) seberte všechny přítomné samičky. Všechny budou panny. Umístěte je do čerstvé kultivační lahvičky a počkejte 2 až 3 dny a hledejte larvy. Panenské samičky mohou klást vajíčka, ale budou sterilní. Vzhledem k tomu, že jsou citlivé na fotoperiodu, samičky mají tendenci uzavírat vajíčka brzy ráno. Časné sběry proto zajistí největší počet panen pro pokusy. Sběr je však možný i později během dne.
Vizuální metoda
Schopnost rozpoznat panenské samičky odstraňuje nutnost včasného vyprazdňování kultivačních lahviček a umožňuje studentům sbírat vlastní, aniž by museli přicházet do třídy v lichou denní dobu. Všimněte si, že panenské samice jsou mnohem větší než starší samice a nemají tmavé zbarvení dospělých samic. Navíc v prvních hodinách po zakuklení bude na spodní straně břicha viditelná tmavě nazelenalá skvrna (mekonium, zbytky jejich poslední potravy před zakuklením).
Cyklování teploty
Pomocí cyklování teploty je možné maximalizovat počet panen v ranním sběru. Pokud jsou kultury udržovány při teplotě 18 °C, je vývoj zpomalen, takže samičky se páří až 16 hodin po uzavření. Odebráním mušek odpoledne/večer a umístěním lahviček do inkubátoru o teplotě 18 °C bude 98 % mušek získaných ráno pannami. Umístěním panen do vlastních lahviček na 2-3 dny se odstraní ta 2 %, která nejsou pannami.
Obrázky panenských samců a samic:

Křížení mušek
Když jsou samice považovány za panenské, přidejte samce. Při zakládání křížení je ideální poměr panenských samic a samců 3:1. Obecně platí, že samci se páří efektivněji, pokud dozráli 3 dny nebo déle. Ujistěte se, že vybíráte silné, zdravé samce; čím jsou mouchy starší, tím je efektivita páření nižší. Páření probíhá rychle a jeho chování je zajímavé sledovat, ale nebudeme se jím zde zabývat. Samičky začínají klást plodná vajíčka brzy po páření. Důkazy o výskytu larev F1 naleznete v tabulce životního cyklu. Dospělce odstraňte, jakmile zjistíte, že je přítomno dostatečné množství larev (obvykle 7-8 dní po křížení), protože nemusíte být schopni rozlišit rodiče od generace F1.
Zabíjení much: Při použití mušek je to bohužel nutnost. Obvykle se používá láhev nebo kádinka s mýdlovou vodou nebo minerálním olejem. Anestezované mouchy vyklopte přímo do mýdlové vody nebo minerálního oleje, kde se utopí. Jako márnici lze také použít láhev (kádinku nebo zavařovací sklenici se šroubovacím uzávěrem) naplněnou ethanolem nebo isopropanolem.
Základní názvosloví a definice genetiky drozofily

Moucha Drosophila melanogaster má 4 chromozomy.
Genotyp se zapisuje jako:

Chromosom
Chromosom nebo Chromosom / Chromosome

Tato běžná nomenklatura zobrazuje jeden chromosom nahoře a jeho homolog dole, jak by se chromosomy objevily během meiózy při přispívání gamet.

Při zápisu genotypu se obecně chromozomy oddělují středníkem.

X chromozom; chromozom II; chromozom III; chromozom IV

Wild-type se označuje jako „+“ nebo WT

Dominantní mutace se píší s velkým písmenem:
Např:

Recesivní mutace se píší s malým písmenem:
Například: bílá nebo w

Mutace jsou alely (alternativní formy genu obsazující daný lokus na chromozomu), které se dědí s chromozomy.

Homozygot – jedinec se stejnou alelou v odpovídajících lokusech na homologních chromozomech.

Heterozygot – Jedinec s různými alelami v odpovídajících lokusech na homologních chromozomech.

Genotyp – Geny, které organismus vlastní.

Fenotyp – Pozorovatelné vlastnosti organismu.

P1 – Rodičovská generace.

F1 – Filiální generace neboli generace potomků. F1 je první generace potomků.

F2 – Druhá generace potomků.
Další skvělé webové zdroje:

Gerard Manning napsal jednoduchý úvod do genetiky drozofily.

Genetika na mouše: A Primer on the Drosophila Model System od Karen G. Hales et al (2015).

Taking Stock of the Drosophila Research Ecosystem od Davida Bildera a Kennetha D. Irvina (2017).