Porovnání množství a kvality DNA pomocí odběru slin po konzumaci jídla a nápojů

Materiály a metody

Získali jsme souhlas institucionální kontrolní komise pro ochranu lidských subjektů Air Force Research Laboratory, číslo protokolu FWR20180101H. Subjekty byly individuálně poučeny a podepsaly dokumenty se souhlasem, jehož svědkem byla třetí strana. Vzorky byly odebrány pěti subjektům pomocí tamponu Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab (Epicentre, Madison, WI) a sady Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit (Isohelix, Kent, UK). Všechny odebrané vzorky byly odebrány ve stejný den s minimálně 30minutovým odstupem mezi jednotlivými odběry nebo v průběhu 3 dnů z důvodu časových omezení účastníků. Každému subjektu byly odebrány dva tampony; každý tampon byl třen o vnitřní stranu každé tváře po dobu 10-15 s. Bylo odebráno šest vzorků slin: podle pokynů výrobce bezprostředně po vypití vody, snědení oběda, vypití syceného nealkoholického nápoje, vypití sportovního nápoje nebo vypití kávy.

Tampony byly extrahovány pomocí roztoku Epicentre QuickExtract™ DNA Extraction Solution 1.0 (Epicentre). První stěr byl zpracován tak, jak je, a druhý byl přečištěn pomocí systému Wizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) s použitím protokolu mikrocentrifugy pro purifikaci genomové DNA z buněčných lyzátů tkáňových kultur. Nebyl proveden žádný krok promývání buněk, protože vzorky již byly v roztoku. Vzorky slin byly extrahovány pomocí sady QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) s upraveným protokolem extrakce slin podle výrobce.

Vzorky byly kvantifikovány pomocí přístroje NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) se sadou Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. NanoDrop byl rovněž použit k posouzení čistoty vzorků porovnáním hodnot absorbance při 260 a 280 nm (A260/A280). Obě metody byly použity podle protokolů výrobce. Extrahované vzorky normalizované na 10 ng/μl na základě koncentrací Qubit byly analyzovány pomocí 2% E-Gel® Precast Agarose Gel (Thermo Fisher Scientific). Ke stanovení kvality extrahované DNA byl použit přístroj Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) spolu s vysoce citlivým DNA čipem.

Vzorky byly poté analyzovány na systému Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) za účelem testování dvou genetických markerů spojených s alergií na arašídy: rs7192 a rs9275596 . Genotypizace s rychlým náběhem s nastavením pre-polymerázové řetězové reakce (PCR) na 60 °C po dobu 1 min, udržovací cyklus 95 °C po dobu 10 min, 40 cyklů 95 °C po dobu 15 s a poté 60 °C po dobu 1 min a post-PCR při 60 °C po dobu 1 min. Byla použita směs TaqPath ProAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Testy na jednonukleotidový polymorfismus (SNP) byly použity v poloviční koncentraci doporučené výrobcem. Konečný objem byl 10 µl.

Výsledky

Metoda extrakce stěrů pomocí roztoku QuickExtract vedla k získání vysokého množství DNA. Hodnoty DNA získané ze stěru bez dalšího zpracování se pohybovaly v rozmezí od 1,38 do 54,2 pg/µl, jak bylo stanoveno na přístroji Bioanalyzer (doplňkový soubor 1: tabulka S1). Předchozí neohlášené výsledky z naší laboratoře však ukázaly, že sekvenační experimenty byly inhibovány, pokud byly knihovny připraveny přímo z extrakcí roztokem QuickExtract. Proto jsme tyto vzorky purifikovali pomocí protokolu purifikace na koloně Wizard, čímž jsme podle očekávání snížili koncentraci (v rozmezí od 2,59 do 38,2 pg/µl) a zlepšili poměry A260/A280 tak, aby se přiblížily obecně přijímanému rozmezí (1,8-2,1).

Spity odebrané podle protokolu výrobce a extrahované pomocí soupravy QIAamp Blood DNA Kit měly rozmezí 1,01 ng/µl až 8,20 ng/µl. Čistota indikovaná měřením A260/A280 byla obvykle v rozmezí pro DNA (viz doplňkový soubor 1: tabulka S1). Žádný ze vzorků slin odebraných po vypití různých nápojů nebo po obědě nevykazoval koncentrace DNA a hodnoty čistoty významně odlišné od vzorků odebraných podle protokolu výrobce (30 minut nalačno) (obr. 1).

Extrahované vzorky normalizované na 10 ng/μl podle odečtu Qubit 4.0 byly provedeny na 2% E-Gelu s použitím 1-kb žebříčku (Additional file 1: Figure S1). Očekávali jsme, že uvidíme pás směrem k horní části gelu představující extrakci DNA s vysokou molekulovou hmotností. Podle očekávání měla extrahovaná DNA z různých metod odběru slin vysokou molekulovou hmotnost. Přestože byly normalizovány na vstup 10 ng/µl, u většiny vzorků stěrů se neobjevil jasný pás, což naznačuje buď přítomnost interferentů náboje, nebo nějaký jiný systematický problém.

Podrobnější analýza velikosti a čistoty na přístroji Bioanalyzer ukázala, že všechny vzorky a všechny podmínky mají převážně vysokomolekulární DNA a podobné koncentrace (obr. 2). Kromě výše zmíněné nízké koncentrace po přečištění extrakce stěrů se při analýze signálů elektroforeogramů neprojevily žádné trendy v kvalitě, velikosti nebo koncentraci DNA související s podmínkami odběru (jídlo nebo pití). Zdá se však, že dochází ke změně v závislosti na předmětu, ačkoli tento jev nebyl dále sledován.

Nakonec jsme pomocí genotypování SNP otestovali vhodnost extrahované DNA pro následné molekulární procesy (obr. 3). Všechny extrahované vzorky od všech subjektů byly úspěšně schopny poskytnout použitelné výsledky pro genotypizaci dvou SNP spojených s alergií na arašídy , s výjimkou jednoho ze vzorků purifikovaného stěru (subjekt 5B).

Diskuse

Při navrhování genetické výzkumné studie, komerčního produktu nebo zdravotnického zásahu jsou použitelnost a shoda s koncovými uživateli dvě zásadní hlediska. Zařízení pro odběr krve, která vyžadují vpichy do kůže, mohou mít nižší compliance z důvodu averze vůči bolesti. Na základě pozorování v naší laboratoři jsme anekdotickým způsobem zaznamenali sníženou míru přihlášení do studií, pokud je primárním rozdílem venepunkce oproti odběru slin. Neprovedli jsme kontrolovanou studii, která by tento jev zkoumala; spíše jsme se rozhodli pokračovat v odběru vzorků slin na základě snadného použití, zjevného zvýšení počtu přihlášených a typu výzkumných studií, které se v naší laboratoři převážně provádějí. Vzhledem k tomu, že naše studie zahrnují vlastní odběr vzorků slin, snažili jsme se zjistit, zda je přítomno dostatečně vysoké množství a kvalita DNA pro použití v navazujících molekulárních aplikacích po různých pravděpodobných podmínkách odběru v terénu, především po různém příjmu potravy a nápojů. Design studie nebyl určen pro křížové srovnání mezi jednotlivci; spíše jsme se snažili porovnat variabilitu odběru vzorků uvnitř subjektu. S ohledem na tento cíl jsme nezaznamenali žádné významné snížení množství DNA způsobené odchylkou od pokynů výrobce, aby se vzorek před odběrem 30 minut postil.

Ačkoli je množství DNA důležité, pro pokročilé techniky molekulární biologie je důležitější kvalita získané DNA. V naší studii jsme zjistili, že odběr vzorků slin po jídle a pití neměl vliv na výtěžnost vysokomolekulární DNA. Taková DNA je rozhodující pro sekvenování nové generace, skenování matic a genotypování pomocí PCR. Navíc experimentální test s použitím dvou nezávislých genetických cílů při genotypování pomocí PCR ukázal, že tyto vzorky jsou vhodné pro molekulární analýzy.

Naším zamýšleným cílem v této studii bylo zjistit, zda kvalitu a množství DNA z odběru slin pomocí soupravy pro odběr DNA ze slin ovlivní nedodržení pokynů výrobce, tj. pití nebo jídlo těsně před odběrem. V souladu s naší hypotézou jsme nezaznamenali rozdíl v množství ani kvalitě izolované DNA.

Závěr

Genetické studie přesáhly oblast čistě vědeckého snažení a jsou nyní běžné mezi spotřebitelskou veřejností. Aby bylo možné optimalizovat lidské vzorky pro tyto studie, snaží se výrobci vyvinout jednoduché a robustní metody odběru. Odběr vzorků ze slin je z těchto metod nejméně invazivní, poskytuje vysokou kvalitu DNA a vynikající stabilitu produktu. Naše studie DNA získané ze slin po konzumaci různých nápojů a/nebo pochutin ukázala, že neexistuje žádný významný rozdíl v množství a kvalitě DNA získané pomocí sady Isohelix GeneFiX Saliva DNA Collection Kit (Isohelix), pokud vzorky nejsou odebírány podle protokolu výrobce. I když je velikost vzorku v této studii malá, pozorování z jiných studií v naší laboratoři jsou v souladu s výsledky našeho systematického srovnání, které zde prezentujeme. Došli jsme proto k závěru, že odběr slin je spolehlivý, neinvazivní způsob sběru vzorků v laboratoři i v terénu a požadavek na 30minutovou abstinenci od jídla a pití je ideální, nikoli absolutní.

.