PMC

DNE v transkripční regulaci

DNE mohou vznikat také v rámci transkripční regulace. DNE lze například získat odstraněním transaktivační domény modulární TF, přičemž zůstane pouze DNA vazebná doména. Tento zkrácený faktor se může chovat jako kompetitivní inhibitor transkripce. Je známo, že k tomu dochází v přírodě. Například protein C/EBP u savců je exprimován jako tři alternativní polypeptidy. Delší polypeptidy obsahují N-koncovou transkripční aktivační doménu, zatímco krátká forma ji postrádá. Protože se dlouhá a krátká izoforma sestavují do homo- a heterodimerů, chová se druhá z nich jako přirozený DN (Zahnow et al., 1997). To je také případ Států 5 a 6 u obratlovců, které jsou schopny dimerizace. Jejich proteolytické zpracování v reakci na fyziologické signály vede k odstranění C-koncové aktivační domény a přeměňuje je na silné inhibitory, které negativně regulují přenos signálu (Nakajima et al., 2003). V rostlinách funguje velké množství proteinů MYB jako transkripční regulátory. U Arabidopsis se proteiny obsahující jeden repeticí MYB vázající DNA, ale postrádající transaktivační doménu, podílejí na specifikaci aspektů osudu epidermálních buněk. Tyto proteiny interagují s jinými TF, včetně proteinů bHLH, a vzhledem k absenci transaktivační domény se chovají jako DN a trans-DN tím, že vytvářejí neaktivní komplexy (Ramsay a Glover, 2005).

Odstranění DNA vazebné domény může také vést k DNE. K tomu dochází u bHLH TF. Jak bylo uvedeno výše, gen Id-1 kóduje přirozeně se vyskytující inhibitor DN této rodiny TF. Kompletní bHLH proteiny (s DNA vazebnou a dimerizační doménou) mohou být exprimovány konstitutivně. Regulovaná exprese Id-1, který obsahuje pouze dimerizační doménu, však vnucuje regulaci aktivity proteinů bHLH (Sun, 1994). Podobný jev se očekává i u rostlin. Například genom Arabidopsis kóduje ∼120 bHLH proteinů, u nichž se předpokládá vazba na DNA, a 27 proteinů s méně základní oblastí, než je pro vazbu nutné (Toledo-Ortiz et al., 2003). Tyto HLH nevázající DNA mohou fungovat podobně jako živočišné Id proteiny, jako negativní regulátory bHLH proteinů prostřednictvím tvorby heterodimerů neschopných vázat DNA (Toledo-Ortiz et al., 2003). Podobné účinky se očekávají u TF patřících do rodiny bZIP (basic domain/leucine zipper), které obsahují základní DNA vazebný motiv, dimerizační doménu leucinového zipu a domény pro transaktivaci. Arabidopsis kóduje 67 proteinů bZIP, u nichž se předpokládá, že všechny fungují jako homo- a/nebo heterodimery (Deppmann et al., 2004). Některé z nich jsou velmi malé a mohou postrádat aktivační domény. V klasickém příkladu u rostlin Fukazawa et al. (2000) objasnili funkci bZIP TF REPRESION OF SHOOT GROWTH (RSG) v giberelinové signalizaci pomocí DN formy RSG, která postrádala transkripční aktivační doménu, a proto při expresi v transgenním tabáku působila jako represe funkce proteinu divokého typu. Kromě toho, v souladu s tím, co bylo řečeno v části zabývající se trans-DN nadměrnou expresí, jsou DNA-proteinové transkripční komplexy také citlivé na rovnováhu dávkování genů (Birchler et al., 2001; Veitia, 2002). Změny této rovnováhy sníženou nebo zvýšenou expresí jedné TF vzhledem k ostatním zapojeným do téhož komplexu mohou vyvolat abnormální fenotypy.

Pro zkoumání některých kvantitativních jemností mutací DN v této souvislosti lze použít jednoduchý model transkripční aktivace. Studie virových systémů a drozofily ukázaly, že transkripce často vykazuje sigmoidální vztah vzhledem ke koncentraci TF. V případě systému reagujícího na jeden typ aktivátoru (A) lze tuto sigmoidální odpověď rozčlenit na dvě hlavní složky: kooperativní vazbu A na promotor (p) cílového genu a synergii (obr. 6). Synergie je výsledkem sladěných interakcí mezi molekulami A již navázanými na promotor a transkripčním strojem (Carey, 1998; Veitia, 2003).

Považte promotor p, který obsahuje dvě vazebná místa pro A. Stejná vazebná místa rozpoznává také varianta a, která může působit jako kompetitivní inhibitor. Předpokládáme, že při interakci molekul A s promotorem může docházet ke kooperativitě. To by mohlo platit i pro interakce mezi A, a a promotorem. Jeden z možných zdrojů kooperativity byl zmíněn výše (tj. že A má tendenci vytvářet dimery v roztoku, což se však zvyšuje během vazby na DNA). Další možností je, že monomery nejsou schopny interagovat v roztoku a že interakce jednoho monomeru s DNA vede k alosterické změně, která zvyšuje afinitu vázaného A k přicházejícímu monomeru. Je také možné, i když méně pravděpodobné, že nedochází k interakcím A-A a že vazba jednoho monomeru na DNA vede ke změně v sousedním místě, která zvyšuje jeho afinitu k nově příchozímu monomeru. Ať už je to jakkoli, kooperativita znamená, že reakce pA + A = pAA probíhá snadněji než p + A = pA.

Vzhledem k existenci synergie je molekulární druh, který nejvíce přispívá k transkripci, promotor obsazený dvěma molekulami aktivátoru: pAA. To také znamená, že pokud je afinitní konstanta pro asociaci komplexu pA a polymerázy KpolA, bude K pro asociaci pAA a polymerázy mnohem vyšší než 2K (řádově K2polA; viz Zlotnick, 1994). Abychom v tomto modelu zohlednili částečnou transaktivační aktivitu, budeme používat Kpola (pro reakci pa + pol) a Kpola2 (pro paa + pol). Za těchto předpokladů lze odvodit rovnici pro transkripční odezvu (TR) jako funkci koncentrace A (a a), jak popisují Veitia (2003) a Veitia a Nijhout (2006) (viz Supplemental Materials online).

S poměrně jednoduchou rovnicí v ruce lze zkoumat několik podmínek: (1) situace divokého typu A/A, (2) kdy chybí alela (A/-) a (3) kdy dochází ke koexpresi A a zkrácené verze a postrádající transaktivační doménu. V posledním případě můžeme rozlišit dvě různé situace: (3a), kdy mutace a ruší kooperativitu, nebo (3b), kdy A a a kooperativně interagují. Konečně můžeme také zkoumat situaci (4), kdy je transaktivační schopnost a normální a kooperativita chybí, a (5), kdy je kooperativita normální, ale transaktivační schopnost je částečná.

Obrázek 7 ukazuje, že TR a vzhledem k maximálnímu výkonu promotoru versus vykazuje sigmoidální vztah, který se pohybuje mezi 0 a 1. Nasycení odráží maximální odezvu systému, ale neznamená to, že promotor funguje pouze při nasycení. Podle obrázku a obecně jsou hodnoty na křivce pro heterozygota A/- v každém bodě nižší než u A/A (pro každou hodnotu relativní , má heterozygot A/- dvakrát méně v absolutním vyjádření než divoký typ). Zajímavé je, že při nízkých relativních koncentracích A je posun mezi křivkami velmi výrazný Y(A/-) je ∼25 % Y(A/A). Jak se však dalo intuitivně očekávat, při vysokých hodnotách A je nasycení dosaženo i u A/-. Pokud by tento systém byl normálně funkční při nízkých koncentracích A, jedinec A/- by vykazoval typický haploinsuficientní fenotyp.

Co se stane u A/a, když a chybí transaktivační doména při absenci kooperativity? Podle klasické definice DN je křivka v každém bodě nižší než u A/-. Existuje však tendence k dosažení nasycení se zvyšující se koncentrací A a. Ve skutečnosti má A tendenci obsazovat přednostně promotor, protože zajišťuje kooperativní interakce s přicházejícími monomery A. A má tendenci obsazovat přednostně promotor. Je však zřejmé, že k rozpoznání promotoru při nízké koncentraci proteinu dochází méně ochotně u A/a než u divokého typu. V praxi povede zkrácený monomer, který není schopen zajistit kooperativní interakce, ke slabému DNE. Situace je zcela odlišná v druhém extrému, kdy je kooperativita mezi A a a plně zachována. Plató křivky pro A/a je skutečně dosaženo při TR = 0,25. To je očekávané, protože pAA, který řídí transkripci (tj. příspěvky pAa a paa jsou zanedbatelné), představuje pouze 25 % obsazených druhů promotoru při saturaci.

Potenciální příklad poskytuje umělá mutace v TF FOXL2. Tato TF potlačuje promotor lidského steroidogenního akutního regulačního genu, který obsahuje několik předpokládaných vazebných míst. Verze FOXL2 obsahující vazebnou doménu DNA, ale postrádající C-koncovou doménu, je schopna vyvolat DNE, která narušuje transkripční represi. Tohoto účinku je však dosaženo pouze v případě, že je DN verze mnohem silněji exprimována (5× a 10×) než protein divokého typu (Pisarska et al., 2004). Jak bylo nastíněno výše, může to být způsobeno absencí kooperativních interakcí mezi molekulami FOXL2 na tomto promotoru.

Výmluvnější příklad je uveden na obrázku 8, který představuje odezvu dvou různých promotorů obsahujících jedno nebo dvě vazebná místa pro TF PTX2a a její DN verzi, jak bylo popsáno dříve (Saadi et al., 2003. Při nízkém množství transfekční DNA (0,05 μg na obrázku 8) je odpověď promotoru se dvěma místy více než dvakrát silnější (tj. 3×) než odpověď promotoru s jedním místem. To je kombinovaný znak kooperativity a synergie. Navíc při vysokých koncentracích transfekčních konstruktů WT+DN je TR promotoru se dvěma vazebnými místy ∼25 % odezvy samotného divokého typu. To se očekává, protože při vysoké koncentraci proteinu mohou být dimery předsestaveny ještě před dosažením cílové DNA. V takovém případě bude pouze 25 % dimerů normálních. Pokles TR je méně dramatický u promotoru s pouze jedním vazebným místem (očekávaných 50 %). Z praktického hlediska, aby nedošlo k přehlédnutí potenciálního DNE při experimentech in vitro, je třeba transfekovat nízké množství konstruktů WT+DN s nadbytkem reportérového promotoru, aby nedošlo k jeho nasycení divokou formou. Obecněji řečeno, pro takové transfekční experimenty by měly být k dispozici křivky odezvy pro různé koncentrace TF.

Jak se intuitivně očekává, pokud je transaktivační schopnost a normální a chybí kooperativita, objevuje se velmi mírné DNE, které vede k chování blízkému nulové alele v heterozygotním stavu. Izolace tohoto druhu mutantů je možná pomocí elegantního genetického screenu kvasinek, který popsali Burz a Hanes (2001). Mutace může ovlivnit úroveň kooperativity méně dramaticky. Zajímavý případ nastává, když kooperativita klesne přibližně na desetinu normální úrovně (podle parametrů, na nichž jsou založeny výsledky uvedené na obrázku 7) a schopnost transaktivace je normální. Za těchto podmínek se varianta a chová jako hypomorfní alela u homozygota a/a a jako nulová alela u A/a (tj. A/a = A/-; údaje nejsou uvedeny). To opět poukazuje na neexistenci zřetelných hranic mezi hypomorfními, DN a nulovými alelami.

Pokud existuje zbytková transaktivace (tj. 1<Kpola<KpolA) a kooperativita je normální, není u A/a dosaženo plató při TR = 1, ale na nižší úrovni. V některých případech mohou snadno vznikat alely s částečnou aktivační schopností. Paradigma poskytuje kvasinkový TF Gal4, který obsahuje dvě aktivační oblasti (ARI a ARII) podílející se na náboru transkripční mašinérie. Delece v kyselé oblasti ARII vedou ke snížení transaktivační kapacity (Ptashne a Gann, 2002; Ptashne, 2007). Kombinace takové alely s divokým typem Gal4 by se měla chovat podle popisu. Jak ukazuje obrázek 7, křivka pro A/a se kříží s křivkou pro A/-. Stejná alela tedy může být hypomorfní, pokud systém funguje při nízkých úrovních nasycení (než se křivky vzájemně protnou) a může být DN v molekulárním smyslu při vyšších koncentracích proteinu. Intuitivní vysvětlení lze poskytnout. Uvažujme například protein a, který interaguje s polymerázou řekněme s 90 % síly divokého typu. Pro určitý rozsah koncentrací bude mít heterozygot A/a tendenci chovat se jako A/A. Při nasycení však bude pouze 25 % druhu promotoru pAA, který interaguje s polymerázou s maximální silou. Naproti tomu u heterozygota A/- je při nízkých koncentracích proteinu obtížnější obsadit promotor, zatímco při nasycení bude 100 % promotoru tvořit pAA. Křivky pro A/a a A/- se tedy musí v určitém bodě protínat.

Všechny cílové promotory v buňce nejsou stejně citlivé na DN TF. Pokud existuje silná kooperativita a synergie, citlivost promotoru na DN protein by měla záviset na počtu vazebných míst na DNA. Nejjednodušší případ pro vizualizaci je, když a postrádá transaktivační doménu, ale kooperativně interaguje s A. Pokud je druh promotoru, který řídí transkripci, plně zatížen proteinem divokého typu, jak se předpokládá výše, lze vypočítat maximální TR pomocí vzorce (binomických pravděpodobností) uvedeného v Supplemental Materials online. Pro promotor se dvěma identickými vazebnými místy bude maximální TR činit 25 % vzhledem k výstupu v divokém stavu: pro tři vazebná místa 12,5 % a pro čtyři vazebná místa 6,25 % (pokud jsou A a a vyjádřeny v ekvimolárních koncentracích). Pro složitější situace není odpověď intuitivní a vyžaduje analýzu modelů, kterými se zde nezabýváme

.