Součásti základního systému vysokoúčinné kapalinové chromatografie jsou znázorněny na jednoduchém schématu na obrázku E.
V zásobníku se nachází rozpouštědlo . Vysokotlaké čerpadlo se používá k vytváření a měření stanoveného průtoku mobilní fáze, obvykle mililitrů za minutu. Injektor je schopen zavést vzorek do kontinuálně proudícího proudu mobilní fáze, který přenáší vzorek do kolony HPLC. Kolona obsahuje chromatografický obalový materiál potřebný k provedení separace. Tento obalový materiál se nazývá stacionární fáze, protože je držen na místě hardwarem kolony. Detektor je potřebný k tomu, aby bylo možné vidět pásy separovaných sloučenin při jejich eluci z kolony HPLC . Mobilní fáze vystupuje z detektoru a může být podle potřeby odeslána do odpadu nebo shromážděna. Pokud mobilní fáze obsahuje pás oddělené sloučeniny, HPLC umožňuje shromáždit tuto frakci eluátu obsahující tuto přečištěnou sloučeninu pro další studium. Tento postup se nazývá preparativní chromatografie .
Všimněte si, že k propojení čerpadla, injektoru, kolony a součástí detektoru se používají vysokotlaké hadičky a šroubení, které tvoří vedení pro mobilní fázi, vzorek a pásy separovaných sloučenin.
Obrázek E: Systém vysokoúčinné kapalinové chromatografie
Detektor je připojen k počítačové datové stanici, součásti systému HPLC, která zaznamenává elektrický signál potřebný k vytvoření chromatogramu na jejím displeji a k identifikaci a kvantifikaci koncentrace složek vzorku (viz obrázek F). Protože vlastnosti složek vzorku mohou být velmi rozdílné, bylo vyvinuto několik typů detektorů. Pokud například sloučenina může absorbovat ultrafialové světlo, používá se UV absorpční detektor. Pokud sloučenina fluoreskuje, použije se fluorescenční detektor. Pokud sloučenina nemá ani jednu z těchto vlastností, používá se univerzálnější typ detektoru, například detektor rozptylu světla odpařováním . Nejúčinnějším přístupem je použití více detektorů v sérii. Například k analýze výsledků chromatografické separace lze použít UV a/nebo ELSD detektor v kombinaci s hmotnostním spektrometrem. To poskytuje z jediného nástřiku komplexnější informace o analytu. Praxe spojení hmotnostního spektrometru se systémem HPLC se nazývá LC/MS.
Obrázek F: Typický systém HPLC
Provoz HPLC
Jednoduchým způsobem, jak pochopit, jak dosáhneme separace sloučenin obsažených ve vzorku, je zobrazení diagramu na obrázku G.
Mobilní fáze vstupuje do kolony zleva, prochází ložem částic a vystupuje vpravo. Směr toku je znázorněn zelenými šipkami. Nejprve se podívejte na horní obrázek; představuje kolonu v nulovém čase , kdy vzorek vstupuje do kolony a začíná tvořit pás. Zde zobrazený vzorek, směs žlutého, červeného a modrého barviva, se objeví na vstupu do kolony jako jediný černý pás.
Po několika minutách , během nichž mobilní fáze nepřetržitě a rovnoměrně protéká kolem částic obalového materiálu, vidíme, že jednotlivá barviva se pohybovala v samostatných pásech různou rychlostí. Je to proto, že mezi mobilní fází a stacionární fází dochází k soutěži o přitahování jednotlivých barviv nebo analytů. Všimněte si, že pás žlutého barviva se pohybuje nejrychleji a chystá se opustit kolonu. Žluté barvivo má mobilní fázi raději než ostatní barviva. Proto se pohybuje vyšší rychlostí, blíže k rychlosti mobilní fáze. Modrý pruh barviva má rád obalový materiál více než mobilní fázi. Jeho silnější přitažlivost k částicím způsobuje, že se pohybuje výrazně pomaleji. Jinými slovy, je to nejvíce zadržovaná sloučenina v této směsi vzorků. Pás červeného barviva má střední přitažlivost pro mobilní fázi, a proto se pohybuje střední rychlostí přes kolonu. Protože se každý pás barviva pohybuje jinou rychlostí, jsme schopni jej chromatograficky oddělit.
Obrázek G: Pochopení fungování chromatografické kolony – pásy
Co je detektor?“
Jakmile oddělené pásy barviva opustí kolonu, okamžitě projdou do detektoru. Detektor obsahuje průtokovou celu, která vidí každý separovaný pás sloučeniny na pozadí mobilní fáze . Vhodný detektor má schopnost snímat přítomnost sloučeniny a vysílat odpovídající elektrický signál do počítačové datové stanice. Volba se provádí mezi mnoha různými typy detektorů v závislosti na vlastnostech a koncentracích sloučenin, které je třeba separovat a analyzovat, jak bylo uvedeno dříve.
Co je chromatogram?
Chromatogram je znázornění separace, která chemicky proběhla v systému HPLC. Na časové ose je vykreslena řada píků stoupajících od základní linie. Každý pík představuje odezvu detektoru pro jinou sloučeninu. Chromatogram vykresluje počítačová datová stanice .
Obrázek H: Jak se vytvářejí píky
Na obrázku H žlutý pás zcela prošel průtokovou buňkou detektoru; vytvořený elektrický signál byl odeslán do počítačové datové stanice. Výsledný chromatogram se začal zobrazovat na obrazovce. Všimněte si, že chromatogram začíná v okamžiku prvního vstříknutí vzorku a začíná jako přímka nastavená blízko spodní části obrazovky. Této linii se říká základní linie; představuje čistou mobilní fázi procházející průtokovou kyvetou v průběhu času. Jak žlutý pás analytu prochází průtokovou kyvetou, vysílá se do počítače silnější signál. Čára se zakřivuje, nejprve směrem nahoru a pak dolů, úměrně koncentraci žlutého barviva v pásmu vzorku. Tím se na chromatogramu vytvoří pík. Poté, co žlutý pás zcela projde detekční kyvetou, úroveň signálu se vrátí na základní linii; v průtokové kyvetě je nyní opět pouze čistá mobilní fáze. Protože se žlutý pás pohybuje nejrychleji a eluuje z kolony jako první, je to první vykreslený pík.
O chvíli později se do průtokové cely dostane červený pás. Signál stoupá od základní linie, když červený pás poprvé vstoupí do cely, a začne se vykreslovat pík představující červený pás. V tomto diagramu červený pás ještě zcela neprošel průtokovou kyvetou. Diagram ukazuje, jak by červený pás a červená špička vypadaly, kdybychom proces v tomto okamžiku zastavili. Protože většina červeného pásu prošla průtokovou kyvetou, byla vykreslena většina píku, jak ukazuje plná čára. Kdybychom mohli znovu spustit, červený pás by zcela prošel průtokovou buňkou a červený pík by byl dokončen . Modrý pás, který je nejsilněji zadržován, prochází nejpomaleji a eluuje se až po červeném pásu. Přerušovaná čára ukazuje, jak by vypadal dokončený chromatogram, kdybychom nechali běh pokračovat až do konce. Je zajímavé, že šířka modrého píku bude nejširší, protože šířka modrého pásu analytu, který je na koloně nejužší, se při eluci z kolony stává nejširší. Je to proto, že se pohybuje pomaleji přes lože chromatografického obalového materiálu a potřebuje více času, aby byl zcela eluován. Vzhledem k tomu, že mobilní fáze nepřetržitě proudí pevnou rychlostí, znamená to, že modrý pás se rozšiřuje a je více zředěný. Protože detektor reaguje úměrně koncentraci pásu, modrý pík má menší výšku, ale větší šířku
.