Enzymová katalýza

Tyto konformační změny také přibližují katalytická rezidua v aktivním místě k chemickým vazbám v substrátu, které se v reakci změní. Poté, co dojde k vazbě, jeden nebo více mechanismů katalýzy snižuje energii přechodového stavu reakce tím, že poskytuje alternativní chemickou cestu pro reakci. Existuje šest možných mechanismů katalýzy „přes bariéru“ a také mechanismus „přes bariéru“:

Blízkost a orientaceEdit

Interakce mezi enzymem a substrátem vyrovnávají reaktivní chemické skupiny a drží je blízko sebe v optimální geometrii, což zvyšuje rychlost reakce. Tím se snižuje entropie reaktantů, a tím se adiční nebo transferové reakce stávají méně nevýhodnými, protože dochází ke snížení celkové entropie, když se ze dvou reaktantů stane jediný produkt. Tento efekt je však obecný a projevuje se i u reakcí, které nejsou adiční nebo přenosové, kde k němu dochází v důsledku zvýšení „efektivní koncentrace“ činidel. To pochopíme, když uvážíme, jak zvýšení koncentrace vede ke zvýšení reakční rychlosti: v podstatě když jsou reaktanty koncentrovanější, častěji se srážejí, a tak častěji reagují. Při enzymové katalýze vazba činidel na enzym omezuje konformační prostor reaktantů, udržuje je ve „správné orientaci“ a blízko sebe, takže se častěji a se správnou geometrií srážejí, což usnadňuje požadovanou reakci. „Efektivní koncentrace“ je koncentrace, kterou by musel mít reaktant volně v roztoku, aby došlo ke stejné frekvenci srážek. Často jsou takové teoretické efektivní koncentrace nefyzikální a ve skutečnosti je nemožné je realizovat – což svědčí o velké katalytické síle mnoha enzymů s obrovským zvýšením rychlosti oproti nekatalyzovanému stavu.

Například:

Podobné reakce budou probíhat mnohem rychleji, pokud je reakce intramolekulární.

Efektivní koncentraci acetátu v intramolekulární reakci lze odhadnout jako k2/k1 = 2 x 105 molárů.

Situace však může být složitější, protože moderní výpočetní studie zjistily, že tradiční příklady proximitních efektů nelze přímo vztahovat k entropickým efektům enzymů. Také bylo zjištěno, že původní entropický návrh do značné míry nadhodnocuje příspěvek orientační entropie ke katalýze.

Donory nebo akceptory protonůUpravit

Donoři a akceptoři protonů, tj. kyseliny a zásady mohou donovat a přijímat protony za účelem stabilizace vyvíjejících se nábojů v přechodném stavu. To souvisí s obecným principem katalýzy, tedy se snižováním energetických bariér, protože obecně jsou přechodné stavy vysokoenergetické stavy a jejich stabilizací se tato vysoká energie snižuje, čímž se snižuje bariéra. Klíčovým rysem enzymové katalýzy oproti mnoha nebiologickým katalýzám je to, že v jedné reakci lze kombinovat jak kyselou, tak bazickou katalýzu. V mnoha abiotických systémech mohou kyseliny (velké ) nebo zásady ( pohlcovače velké koncentrace H+ nebo druhy s elektronovými páry) zvýšit rychlost reakce; prostředí však samozřejmě může mít pouze jedno celkové pH (míra kyselosti nebo zásaditosti (alkality)). Jelikož jsou však enzymy velké molekuly, mohou ve svém aktivním místě umístit jak kyselé, tak zásadité skupiny, aby interagovaly se svými substráty, a využívat oba způsoby nezávisle na celkovém pH.

Často se obecná kyselá nebo zásaditá katalýza využívá k aktivaci nukleofilních a/nebo elektrofilních skupin nebo ke stabilizaci odcházejících skupin. V aktivním místě se takto uplatňuje mnoho aminokyselin s kyselými nebo bazickými skupinami, například kyselina glutamová a asparagová, histidin, cystin, tyrosin, lysin a arginin, jakož i serin a treonin. Kromě toho se často používá peptidová páteř s karbonylovými a amidovými N skupinami. Velmi často se zapojují cystin a histidin, protože oba mají pKa blízké neutrálnímu pH, a mohou tedy přijímat i darovat protony.

Mnoho reakčních mechanismů zahrnujících acidobazickou katalýzu předpokládá podstatně změněné pKa. Tato změna pKa je možná díky lokálnímu prostředí zbytku.

Podmínky	Kyseliny	Báze
Hydrofobní prostředí	Zvýšení pKa	Snížení pKa
Sousední zbytky se stejným nábojem	Zvýšení. pKa	Snížení pKa
Tvorba solných můstků (a vodíkových vazeb)	Snížení pKa	Snížení pKa

pKa může být také výrazně ovlivněna okolním prostředím, do té míry, že zbytky, které jsou v roztoku bazické, mohou působit jako donory protonů a naopak.

Například:

Katalytická triáda serinové proteázy

Počáteční krok katalytického mechanismu serinové proteázy zahrnuje histidin aktivního místa přijímající proton ze serinového zbytku. Tím se serin připraví jako nukleofil k útoku na amidovou vazbu substrátu. Tento mechanismus zahrnuje donaci protonu ze serinu (báze, pKa 14) na histidin (kyselinu, pKa 6), která je umožněna díky lokálnímu prostředí bází.

Je důležité objasnit, že změna pKa je čistě součástí elektrostatického mechanismu. Kromě toho je katalytický účinek výše uvedeného příkladu spojen především se snížením pKa oxyaniontu a zvýšením pKa histidinu, zatímco přenos protonu ze serinu na histidin není významně katalyzován, protože není bariérou určující rychlost.

Elektrostatická katalýzaEdit

Stabilizace nabitých přechodných stavů může být také tím, že zbytky v aktivním místě vytvářejí iontové vazby (nebo částečné interakce iontového náboje) s meziproduktem. Tyto vazby mohou pocházet buď z kyselých nebo zásaditých postranních řetězců nacházejících se na aminokyselinách, jako je lysin, arginin, kyselina asparagová nebo kyselina glutamová, nebo mohou pocházet z kovových kofaktorů, jako je zinek. Zvláště účinné jsou ionty kovů, které mohou snížit pKa vody natolik, že se z ní stane účinný nukleofil.

Systematické počítačové simulační studie prokázaly, že elektrostatické účinky mají zdaleka největší podíl na katalýze. Mohou zvýšit rychlost reakce až 107krát. Zejména bylo zjištěno, že enzym poskytuje prostředí, které je polárnější než voda, a že iontové přechodné stavy jsou stabilizovány pevnými dipóly. To je velmi odlišné od stabilizace přechodových stavů ve vodě, kde musí molekuly vody platit „reorganizační energií“. Aby se stabilizovaly iontové a nabité stavy. Katalýza je tedy spojena s tím, že polární skupiny enzymu jsou předem uspořádány

Ukázalo se, že velikost elektrostatického pole působícího v aktivním místě enzymu je vysoce korelována se zvýšením katalytické rychlosti enzymu

Vazba substrátu obvykle vylučuje vodu z aktivního místa, čímž snižuje lokální dielektrickou konstantu na konstantu organického rozpouštědla. To posiluje elektrostatické interakce mezi nabitými/polárními substráty a aktivními místy. Studie navíc ukázaly, že rozložení náboje kolem aktivních míst je uspořádáno tak, aby stabilizovalo přechodné stavy katalyzovaných reakcí. U několika enzymů tato rozložení nábojů zřejmě slouží k vedení polárních substrátů směrem k jejich vazebným místům, takže rychlosti těchto enzymatických reakcí jsou vyšší než jejich zjevné limity řízené difuzí.

Například:

Katalytický mechanismus karboxypeptidázy

Tetraedrický meziprodukt je stabilizován částečnou iontovou vazbou mezi iontem Zn2+ a záporným nábojem na kyslíku.

Kovalentní katalýzaEdit

Kovalentní katalýza zahrnuje substrát, který vytváří přechodnou kovalentní vazbu se zbytky v aktivním místě enzymu nebo s kofaktorem. Tím se do reakce přidá další kovalentní meziprodukt a pomůže se snížit energie pozdějších přechodových stavů reakce. Kovalentní vazba musí být v pozdější fázi reakce přerušena, aby se enzym regeneroval. Tento mechanismus využívá katalytická triáda enzymů, jako jsou proteázy, např. chymotrypsin a trypsin, kde vzniká acyl-enzymový meziprodukt. Alternativním mechanismem je tvorba schiffovy báze pomocí volného aminu z lysinového zbytku, jak je vidět u enzymu aldolázy při glykolýze.

Některé enzymy využívají neaminokyselinové kofaktory, jako je pyridoxalfosfát (PLP) nebo thiaminpyrofosfát (TPP), k tvorbě kovalentních meziproduktů s molekulami reaktantů. Tyto kovalentní meziprodukty fungují tak, že snižují energii pozdějších přechodových stavů, podobně jako kovalentní meziprodukty tvořené s aminokyselinovými zbytky aktivního místa umožňují stabilizaci, ale schopnosti kofaktorů umožňují enzymům provádět reakce, které by samotné aminokyselinové vedlejší zbytky provádět nemohly. Mezi enzymy využívající takové kofaktory patří PLP-dependentní enzym aspartáttransamináza a TPP-dependentní enzym pyruvátdehydrogenáza.

Kovalentní katalýza spíše než snížení aktivační energie pro reakční dráhu poskytuje alternativní cestu pro reakci (přes ke kovalentnímu meziproduktu), a tak se liší od skutečné katalýzy. Například energetiku kovalentní vazby na molekulu serinu v chymotrypsinu je třeba porovnat s dobře pochopenou kovalentní vazbou na nukleofil v nekatalyzované reakci v roztoku. Skutečný návrh kovalentní katalýzy (kde je bariéra nižší než odpovídající bariéra v roztoku) by vyžadoval např. částečnou kovalentní vazbu k přechodnému stavu enzymovou skupinou (např. velmi silnou vodíkovou vazbu), a takové efekty ke katalýze významně nepřispívají.

Katalýza kovovými iontyEdit

Kovový ion v aktivním místě se podílí na katalýze koordinační stabilizací náboje a stíněním. Vzhledem ke kladnému náboji kovu lze prostřednictvím kovových iontů stabilizovat pouze záporné náboje. Ionty kovů jsou však v biologické katalýze výhodné, protože na ně nemají vliv změny pH. Ionty kovů mohou také působit na ionizaci vody tím, že působí jako Lewisova kyselina. Ionty kovů mohou být také činiteli oxidace a redukce.

Vazbové napětíEdit

Jedná se o hlavní efekt indukované vazby fit, kdy je afinita enzymu k přechodnému stavu větší než k samotnému substrátu. To vyvolává strukturní přestavby, které napínají vazby substrátu do polohy bližší konformaci přechodného stavu, takže snižují energetický rozdíl mezi substrátem a přechodným stavem a pomáhají katalyzovat reakci.

Efekt napětí je však ve skutečnosti spíše efektem destabilizace základního stavu než efektem stabilizace přechodného stavu. Kromě toho jsou enzymy velmi flexibilní a nemohou uplatnit velký deformační efekt.

Kromě deformace vazby v substrátu může být deformace vazby vyvolána také uvnitř samotného enzymu k aktivaci zbytků v aktivním místě.

Příklad:

Konformace substrátu, vázaného substrátu a přechodného stavu lysozymu.

Substrát, při vazbě, je deformován z polokřeslové konformace hexózového kruhu (kvůli sterickým překážkám s aminokyselinami proteinu, které nutí ekvatoriální c6 být v axiální poloze) do křeslové konformace

Kvantové tunelováníEdit

Tyto tradiční mechanismy „přes bariéru“ byly v některých případech zpochybněny modely a pozorováními mechanismů „přes bariéru“ (kvantové tunelování). Některé enzymy pracují s kinetikou, která je rychlejší, než by předpovídalo klasické ΔG‡. V modelech „přes bariéru“ může proton nebo elektron tunelovat přes aktivační bariéry. Kvantové tunelování pro protony bylo pozorováno při oxidaci tryptaminu aromatickou amindehydrogenázou.

Nezdá se, že by kvantové tunelování poskytovalo významnou katalytickou výhodu, protože tunelové příspěvky jsou podobné u katalyzovaných i nekatalyzovaných reakcí v roztoku. Nicméně příspěvek tunelování (typicky zvyšující rychlostní konstanty o faktor ~1000 ve srovnání s rychlostí reakce u klasické cesty „přes bariéru“) je pravděpodobně klíčový pro životaschopnost biologických organismů. To zdůrazňuje obecný význam tunelových reakcí v biologii.

V letech 1971-1972 byl formulován první kvantově-mechanický model enzymové katalýzy.

Aktivní enzymEdit

Vazbovou energii komplexu enzym-substrát nelze považovat za vnější energii, která je nezbytná pro aktivaci substrátu. Enzym s vysokým obsahem energie může nejprve přenést určitou specifickou energetickou skupinu X1 z katalytického místa enzymu na konečné místo prvního vázaného reaktantu, poté musí být další skupina X2 z druhého vázaného reaktantu (nebo z druhé skupiny jediného reaktantu) přenesena do aktivního místa, aby se dokončila přeměna substrátu na produkt a regenerace enzymu.

Celou enzymatickou reakci můžeme představit jako dvě spojovací reakce:

S 1 + EX 1 ⟶ S 1 EX 1 ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {\ce {{S1}+ EX1 -> S1EX1 -> {P1}+ EP2}}}

(1)

S 2 + EP 2 ⟶ S 2 EP 2 ⟶ P 2 + EX 2 {\displaystyle {\ce {{S2}+ EP2 -.> S2EP2 -> {P2}+ EX2}}}

(2)

Z reakce (1) je patrné, že skupina X1 aktivního enzymu se objevuje v produktu díky možnosti výměnné reakce uvnitř enzymu, aby se zabránilo elektrostatické inhibici i odpuzování atomů. Představujeme tedy aktivní enzym jako silný reaktant enzymatické reakce. Reakce (2) vykazuje neúplnou přeměnu substrátu, protože jeho skupina X2 zůstává uvnitř enzymu. Tento přístup jako myšlenka byl dříve navržen na základě hypotetických extrémně vysokých enzymatických konverzí (katalyticky dokonalý enzym).

Klíčovým bodem pro ověření tohoto přístupu je, že katalyzátorem musí být komplex enzymu s přenosovou skupinou reakce. Toto chemické hledisko je podpořeno dobře prostudovanými mechanismy několika enzymatických reakcí. Uvažujme reakci hydrolýzy peptidové vazby katalyzovanou čistým proteinem α-chymotrypsinem (enzymem působícím bez kofaktoru), který je dobře prostudovaným členem rodiny serinových proteáz, viz.

Předkládáme experimentální výsledky pro tuto reakci jako dva chemické kroky:

S 1 + EH ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {\ce {{S1}+ EH -> {P1}+ EP2}}}.

(3)

EP 2 + H – O – H ⟶ EH + P 2 {\displaystyle {\ce {{EP2}+ {H-O-H}-> {EH}+ P2}}}

(4)

kde S1 je polypeptid, P1 a P2 jsou produkty. První chemický krok (3) zahrnuje tvorbu kovalentního acyl-enzymového meziproduktu. Druhý krok (4) je deacylační krok. Je důležité poznamenat, že skupina H+, která se původně nachází na enzymu, ale ne ve vodě, se objevuje v produktu před krokem hydrolýzy, proto ji lze považovat za další skupinu enzymatické reakce.

Reakce (3) tedy ukazuje, že enzym působí jako silný reaktant reakce. Podle navržené koncepce podporuje transport H z enzymu přeměnu prvního reaktantu, rozpad první počáteční chemické vazby (mezi skupinami P1 a P2). Krok hydrolýzy vede k rozpadu druhé chemické vazby a regeneraci enzymu.

Navržený chemický mechanismus nezávisí na koncentraci substrátů nebo produktů v prostředí. Změna jejich koncentrace však způsobuje především změny volné energie v prvním a závěrečném kroku reakcí (1) a (2) v důsledku změn obsahu volné energie každé molekuly, ať už S nebo P, ve vodném roztoku. tento přístup je v souladu s následujícím mechanismem svalové kontrakce. Posledním krokem hydrolýzy ATP v kosterním svalu je uvolnění produktu způsobené spojením hlavic myozinu s aktinem. Uzavření aktinové vazebné štěrbiny během asociační reakce je strukturálně spojeno s otevřením nukleotidové vazebné kapsy na aktivním místě myosinu.

Konečné kroky hydrolýzy ATP zahrnují rychlé uvolnění fosfátu a pomalé uvolnění ADP.Uvolnění fosfátového aniontu z vázaného aniontu ADP do vodného roztoku lze považovat za exergonickou reakci, protože fosfátový aniont má nízkou molekulovou hmotnost.

Docházíme tedy k závěru, že primární uvolnění anorganického fosfátu H2PO4- vede k přeměně významné části volné energie hydrolýzy ATP na kinetickou energii solvatovaného fosfátu, čímž vzniká aktivní proudění. Tento předpoklad lokální mechanicko-chemické transdukce je v souladu s Tiroshovým mechanismem svalové kontrakce, kde svalová síla pochází z integrovaného působení aktivního proudění vytvořeného hydrolýzou ATP

.