Diagnosis of Legionella Infection

Abstract

Legionely, které jsou významnými původci pneumonie u lidí, jsou stále nesprávně označovány jako exotické patogeny. Schopnost diagnostikovat legionelovou infekci je omezena nespecifičností klinických příznaků a nedostatky diagnostických testů. Navzdory nedávným zlepšením nejsou stávající diagnostické testy na infekci legionelou buď dostatečně citlivé pro detekci všech klinicky významných legionel, nebo nejsou schopny poskytnout výsledky v klinicky užitečném časovém horizontu. Pochopení místní epidemiologie legionel je důležité pro rozhodování o tom, zda testovat infekci legionelou a jaké diagnostické testy použít. Ve většině situací je nejlepší diagnostickou kombinací použití testu na močové antigeny i kultivace sputa. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je slibným nástrojem, ale standardizované testy nejsou komerčně dostupné. Další práce se musí zaměřit na vývoj testů močových antigenů, které detekují širší spektrum patogenních legionel, a na vývoj standardizovaných testů PCR.

Legionářská nemoc má nadále pověst exotické infekce. Naopak, při systematickém vyhledávání jsou legionely důsledně uznávány jako jedna z běžných příčin pneumonie. Mimo výzkumné prostředí jsou však potvrzené diagnózy legionelózy vzácné. Tato neschopnost diagnostikovat legionářskou nemoc v rutinní praxi je do značné míry důsledkem 3 faktorů: neschopnosti klinicky a rentgenologicky odlišit legionářskou nemoc od jiných příčin pneumonie, neobjednání diagnostických testů na legionelovou infekci a nedostatků dostupných diagnostických testů. Legionářská nemoc je přesněji popsána jako nepolapitelná diagnóza než jako exotická infekce.

Ačkoli se diagnostické metody během 25 let od prvního popisu Legionella pneumophila zlepšily, žádný v současnosti dostupný test není schopen včas diagnostikovat legionářskou nemoc s vysokou mírou citlivosti a specifičnosti. Někteří autoři skutečně zpochybňují rutinní objednávání jakýchkoli mikrobiologických testů u pacientů s pneumonií, což podporují údaji, které naznačují, že tyto testy nemají významný vliv na volbu antibiotické terapie a výsledek léčby pacienta . Marrie nedávno tvrdil, že tento přístup k diagnostice legionářské nemoci je chybný. Neprovádění testů na legionelovou infekci může zpozdit rozpoznání ohnisek legionářské nemoci, může přehlédnout změny v epidemiologii nemoci (včetně vývoje antimikrobiální rezistence) a může zabránit osobám žádat o odškodnění za infekci získanou při výkonu povolání. Důležité je, že je možné vybrat podskupinu pacientů, u nichž je výtěžnost diagnostických testů na legionelovou infekci vysoká a kteří by měli prospěch z konkrétní diagnózy.

Tento přehled se zaměřuje na současné diagnostické testy na legionelovou infekci se zvláštním důrazem na testy, které poskytují diagnózu v časovém rámci, který ovlivní počáteční léčbu infekce. Při přehledu různých diagnostických testů na infekci Legionella je důležité mít na paměti několik faktorů. Za prvé, k diagnostice infekce Legionella jsou zapotřebí specializované testy, které si musí klinický lékař výslovně vyžádat. Za druhé je důležité si uvědomit rozdíl mezi provedením testu ve výzkumné laboratoři a tím, čeho lze reálně dosáhnout v místní diagnostické laboratoři. U schopnosti kultivace legionel byly zdokumentovány značné mezilaboratorní rozdíly, které se pravděpodobně týkají i dalších testů. Za třetí, interpretaci výsledků diagnostických testů ztěžuje neexistence vhodného „zlatého standardu“. Vypočtené údaje o citlivosti a specifičnosti se budou lišit podle různých srovnávacích standardů. Začtvrté, užitečnost diagnostických testů je ovlivněna místní epidemiologií legionel. L. pneumophila séroskupiny 1 je převládající příčinou legionelózy v mnoha, ne-li většině oblastí světa a infekce tímto organismem se diagnostikuje snadněji než infekce jinými druhy a séroskupinami legionel. V některých oblastech jsou důležitější jiné druhy a séroskupiny. Například Legionella longbeachae je hlavní příčinou legionelózy v Austrálii a na Novém Zélandu , kde je často spojována s expozicí směsi pro květináče. Infekce tímto druhem nebude detekována současnými testy na močové antigeny a bude přehlédnuta laboratořemi, které provádějí sérologické testy pouze na L. pneumophila.

Kultivace

Kultivační diagnostika vyžaduje speciální média, odpovídající zpracování vzorků a technické znalosti (tabulka 1). K získání pozitivního výsledku je zapotřebí několik dní, přičemž většina kolonií legionelly je detekována během 3-5 dní. Standardním médiem používaným ke kultivaci legionel je pufrovaný uhličitano-kvasinkový extrakt (BCYE) agar doplněný α-ketoglutarátem, s antimikrobiálními látkami nebo bez nich. Toto médium poskytuje železo a L-cystein, které jsou pro růst legionel nezbytné. Růst některých druhů legionel (např. Legionella micdadei a Legionella bozemanii) se zvyšuje doplněním BCYE agaru hovězím sérovým albuminem a přidání indikátorových barviv do média může pomoci při identifikaci. Kultivační média obsahující cefamandol inhibují růst druhů Legionella, které neprodukují β-laktamázu, jako jsou L. micdadei a L. bozemanii .

Legionely lze izolovat z různých typů vzorků, ačkoli sekrety dolních cest dýchacích (např, sputum a bronchoskopické vzorky) jsou vzorky volby. Hlavním omezením kultivace sputa je, že méně než polovina pacientů s legionářskou nemocí produkuje sputum . Citlivost kultivace po získání vzorku sputa ovlivňují i další faktory. Bakterie legionel mohou špatně přežívat v respiračních sekretech a tyto vzorky by měly být zpracovány neprodleně. Někteří pacienti s legionářskou nemocí produkují sputum, které je relativně málo hnisavé; tyto vzorky mohou být odmítnuty laboratořemi, které vyřazují vzorky sputa obsahující málo polymorfonukleárních leukocytů . Proto by se na vzorky sputa zaslané ke kultivaci na legionely neměla uplatňovat kritéria pro odmítnutí. Důležitá je také zkušenost laboratorního personálu a laboratoře se zkušenostmi s kultivací legionel mají větší pravděpodobnost záchytu organismu.

Odhadovaná citlivost kultivace sputa se pohybuje od <10 % do ∼80 % a liší se podle různých srovnávacích standardů a podle jednotlivých laboratoří . V praxi je pravděpodobné, že lepších výsledků dosáhnou pouze laboratoře se zvláštním zájmem o legionelové infekce, a citlivost je obvykle <50 %, pokud se jako standard použijí sérologické nálezy. Bronchoskopické vzorky pravděpodobně poskytnou vyšší diagnostickou výtěžnost než vzorky expektorovaného sputa.

Druhy legionel lze izolovat z krevních kultur, ale výtěžnost je nízká. Růst legionel je udržován běžnými médii pro kultivaci krve, ale nemusí aktivovat alarm komerčních přístrojů pro kultivaci krve . V důsledku toho je nutné provádět subkultivace naslepo na pevná média. Celkově je výtěžnost krevních kultur nízká a pravděpodobně neovlivní klinický management.

Přímé barvení fluorescenčními protilátkami (Dfa)

Barvení Dfa může odhalit legionely v respiračních sekretech a vzorcích tkání. Tato technika má tu výhodu, že poskytuje výsledek během 2-4 hodin, ale je technicky náročná a měl by ji provádět zkušený laboratorní personál. Uváděná citlivost barvení DFA se liší, je trvale nižší než citlivost kultivace a není tak přesně známa pro jiné druhy než L. pneumophila. U sekretů dolních cest dýchacích se citlivost obecně pohybuje v rozmezí 25-66 %, přičemž vzorky bronchoalveolární laváže mají vyšší výtěžnost než vzorky transtracheální nebo sputa. Specifičnost barvení DFA byla odhadnuta na ∼94 % , ačkoli v nezkušených rukou je test pravděpodobně méně specifický. Falešně pozitivní výsledky se mohou objevit v důsledku zkřížených reakcí s jinými bakteriemi, včetně druhů Bacteroides fragilis, Pseudomonas, Stenotrophomonas a Flavobacterium. Zkřížené reakce mohou být menším problémem, pokud se používají přípravky DFA s monoklonálními protilátkami. Problémy s citlivostí a specifičností omezily použití barvení DFA a pozitivní výsledek DFA při absenci dalších podpůrných důkazů není nyní obecně přijímán jako dostatečný pro diagnózu infekce legionelou.

Detekce antigenu v moči

Detekce rozpustného antigenu legionel ve vzorcích moči je rychlá metoda, která poskytuje včasnou diagnózu infekce legionelou a je užitečným nástrojem pro vyšetřování ohnisek legionářské nemoci . Komerční soupravy, které využívají metodiku RIA i EIA, jsou k dispozici již několik let a mají podobné výkonnostní charakteristiky. Nedávno byl vyvinut imunochromatografický test (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax), který má podobnou citlivost a specifičnost jako EIA . Tento test se snadno provádí a může poskytnout výsledek do 15 minut.

Pro detekci L. pneumophila séroskupiny 1 mají testy na močový antigen citlivost v rozmezí 70-100 % a specifičnost blížící se 100 % . Citlivost lze zvýšit až o 20 % 25násobnou koncentrací vzorků moči před testováním . Hlavní nevýhodou těchto testů je jejich neschopnost spolehlivě detekovat jiné organismy než L. pneumophila séroskupiny 1. Byly vyvinuty širokospektrální testy, které detekují rozpustné antigeny široké škály druhů Legionella, ale nejsou komerčně dostupné. Biotest Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) je určen k detekci jiných legionel než L. pneumophila séroskupiny 1, ale detekuje je méně spolehlivě než L. pneumophila séroskupiny 1 . U pacientů se sérovou nemocí se vyskytly falešně pozitivní výsledky močového antigenu .

Legionella antigenuria může být zjištěna již 1 den po nástupu příznaků a přetrvává několik dní až týdnů. V jednom případě bylo zdokumentováno vylučování antigenu po dobu >300 dní . Rozpustné antigeny legionel byly zjištěny i v jiných vzorcích než v moči, včetně vzorků sputa, plicní tkáně, séra a pleurální tekutiny, ačkoli použití těchto vzorků nebylo plně vyhodnoceno.

Testování močových antigenů je nyní zavedeným a cenným nástrojem pro diagnostiku legionářské nemoci, zejména v oblastech, kde je L. pneumophila séroskupiny 1 nejčastější příčinou onemocnění. V lokalitách, kde je pouze menšina infekcí způsobena L. pneumophila séroskupiny 1, přispívají v současnosti dostupné testy močových antigenů ke stávajícím laboratorním testům méně.

Serologické testování

Serologické testování na infekci legionelou je cenným epidemiologickým nástrojem, ale má malý dopad na klinické rozhodování kvůli časové prodlevě, než je k dispozici výsledek. Protilátky produkované v reakci na infekci jsou obecně směsí IgA, IgM a IgG a testy by měly pro optimální citlivost detekovat všechny typy. Měření specifického IgM je nespolehlivým markerem akutní infekce, protože protilátky IgM mohou přetrvávat po dlouhou dobu. Sérokonverze může trvat několik týdnů, což je hlavní omezení sérologického testování. Ve většině případů je čtyřnásobné zvýšení titru protilátek zjištěno během 3-4 týdnů, ale v některých případech to může trvat >10 týdnů . Získání vzorků séra v rekonvalescentní fázi příliš brzy nepochybně vede k mnoha falešně negativním výsledkům a pravděpodobně částečně vysvětluje 20-30 % pacientů s legionářskou nemocí, u kterých se údajně nevyvine detekovatelná protilátková odpověď . Je však zřejmé, že u části osob s prokázanou legionelovou infekcí nedochází k detekovatelné sérokonverzi . V praxi by měli být kliničtí lékaři vybízeni k získávání vzorků séra z rekonvalescentní fáze pro testování souběžně se sérem získaným v akutní fázi. Pokud po této době nedojde k sérokonverzi a stále existuje podezření na infekci legionelou, měl by být získán další vzorek z rekonvalescentní fáze.

Z různých dostupných metod detekce protilátek je standardním referenčním testem nepřímá imunofluorescence. Za diagnostický se považuje čtyřnásobné nebo vyšší zvýšení recipročního titru protilátek proti ⩾128. Reciproční titr protilátek v akutní fázi ⩾256 v přítomnosti pneumonie byl kdysi považován za dostatečný pro presumptivní diagnózu, ale ukázalo se, že to není spolehlivé , zejména vzhledem k vysoké prevalenci pozitivity protilátek proti legionelám u některých osob bez klinických známek legionelózy. Testování jednotlivých vzorků séra prakticky nemá význam.

Další nevýhodou sérologického testování je neschopnost přesně detekovat všechny druhy a séroskupiny legionel. Ačkoli sérokonverze na séroskupinu 1 L. pneumophila je obecně považována za vysoce prediktivní pro onemocnění, citlivost a specifičnost sérokonverze na jiné druhy a séroskupiny nebyla důsledně potvrzena. Kromě toho může tvorba zkříženě reagujících protilátek mezi členy čeledi Legionellaceae ztěžovat určení infikujícího druhu nebo séroskupiny. U některých pacientů s infekcí jinou než L. pneumophila séroskupiny 1 dojde k sérokonverzi na L. pneumophila séroskupiny 1 . Naopak sekvenční identifikace produktů PCR legionel u pacientů, u nichž došlo k sérokonverzi na jiné druhy legionel než L. pneumophila, naznačuje, že někteří byli pravděpodobně infikováni L. pneumophila (nepublikovaná pozorování). Zkříženě reagující protilátky se příležitostně vyskytují také u pacientů s infekcemi způsobenými jinými bakteriemi než Legionella, včetně pseudomonád, mykobakterií, druhů Bacteroides a Campylobacter. Zajímavá zkřížená reakce se vyskytuje mezi L. bozemanii a Rickettsia typhi v důsledku společného antigenu .

Amplifikace nukleových kyselin

V poslední době se techniky detekce DNA ukázaly jako slibné pro rychlou diagnostiku infekce legionelou. PCR umožňuje specifickou amplifikaci nepatrného množství DNA legionel, poskytuje výsledky v krátkém čase a má potenciál odhalit infekce způsobené jakýmkoli druhem a séroskupinou legionel. V současné době je PCR na legionely dostupná pouze v omezeném počtu laboratoří, které používají různé interní testy.

PCR byla úspěšně použita k detekci DNA legionel v řadě environmentálních a klinických vzorků. Při testování vzorků z dolních cest dýchacích bylo opakovaně prokázáno, že PCR má stejnou nebo vyšší citlivost než kultivace . PCR lze skutečně považovat za test volby u pacientů, kteří produkují sputum. Úloha PCR při testování jiných typů vzorků je méně jasná. DNA legionel lze detekovat ve vzorcích moči, séra a leukocytů získaných od pacientů s legionářskou nemocí s citlivostí 30-86 % . Citlivost PCR se pravděpodobně zvýší při testování vzorků získaných na počátku onemocnění a při testování >1 typu vzorku od každého pacienta . Vhodným vzorkem pro testování metodou PCR mohou být také výtěry z krku, ale tato aplikace byla hodnocena pouze v jediné studii .

Je zapotřebí další práce pro stanovení standardní metody PCR, která bude dostatečně robustní pro použití mimo prostředí výzkumné laboratoře. Její použití na nedýchací vzorky je obzvláště atraktivní, protože se tím obejde problém pacientů, kteří neposkytují vzorky sputa. Vývoj optimálního testu PCR byl komplikován občasnou kontaminací některých komerčních souprav pro extrakci DNA legionelovou DNA . Použití těchto souprav ke zpracování vzorků může vést k falešně pozitivním výsledkům a zdůrazňuje důležitost zahrnutí vhodných kontrol do každého testu.

Strategie testování

Protože legionářskou nemoc nelze klinicky ani rentgenologicky odlišit od jiných příčin pneumonie, může být rozhodnutí o testování na legionelovou infekci obtížné a často se provádí chybně. Je důležité znát místní epidemiologii. Některé laboratoře v oblastech, kde jsou legionely běžnou příčinou pneumonie, se rozhodly rutinně kultivovat všechny vzorky sputa získané od pacientů s pneumonií na legionelových médiích. Jen málo laboratoří by však bylo schopno ospravedlnit dodatečné náklady spojené s rutinní kultivací legionel. Na většině míst není výskyt legionelové infekce znám a rozhodnutí objednat diagnostické testy na legionelovou infekci se obvykle omezuje na rizikové pacienty, pacienty s těžkou pneumonií a na scénáře vypuknutí epidemie. Je jistě možné vybrat podskupinu pacientů, u nichž bude výtěžnost diagnostických testů na legionellu pravděpodobně relativně vysoká. Do této skupiny patří starší osoby, kuřáci, imunosuprimovaní jedinci, osoby s chronickým plicním onemocněním, pacienti pobývající v nemocnicích s vodovodními sítěmi kolonizovanými bakterií Legionella a osoby vystavené působení směsi na nádobí. Výskyt legionářské nemoci je vyšší u pacientů s těžkým zápalem plic a všichni pacienti se zápalem plic, kteří jsou přijati na jednotku intenzivní péče, by měli být testováni na tuto infekci.

V lokalitách, kde je séroskupina 1 L. pneumophila převládající příčinou legionelové infekce, nebo během vypuknutí infekce séroskupinou 1 L. pneumophila, je test na močový antigen obzvláště cenným diagnostickým nástrojem. Vývoj komerčního testu na močové antigeny, který by spolehlivě detekoval i další lidské patogeny Legionella, by znamenal velký pokrok a pravděpodobně by z něj učinil diagnostický test volby téměř ve všech prostředích. V geografických lokalitách, kde jsou početně významnými patogeny jiné legionely než L. pneumophila séroskupiny 1, jsou současné testy na močové antigeny stále užitečné, ale neměly by být používány jako jediný diagnostický nástroj. Pokud je k dispozici PCR na legionely v kombinaci s testováním močových antigenů, je pravděpodobně nejlepší počáteční testovací strategií, která odhalí všechny druhy legionel a poskytne výsledky v časovém rámci, který ovlivní klinický management.

Pokud PCR není k dispozici, je nejlepší kombinací testů test močových antigenů v kombinaci s kultivací vzorků z dolních cest dýchacích. Kultivace zůstává důležitým diagnostickým nástrojem, ale její relativně nízká citlivost a závislost na dostupnosti vzorku dolních cest dýchacích ji činí nevhodnou jako jediný diagnostický test. Ačkoli sérologické vyšetření nemá žádný vliv na počáteční léčbu, může být užitečné, pokud není stanovena specifická diagnóza během akutní fáze infekce, ale vzorky z akutní i rekonvalescentní fáze musí být testovány souběžně. Během podezření na propuknutí legionářské nemoci je oprávněný agresivní přístup k diagnostice, který by zahrnoval použití kombinace testovacích metod.

Legionella species mohou příležitostně způsobit horečku Pontiac, akutní, horečnaté, neplicní onemocnění, které se vyznačuje vysokou četností atak, krátkou inkubační dobou a rychlým uzdravením. Diagnóza horečky Pontiac se obvykle opírá o rozpoznání typických klinických příznaků během epidemické situace a diagnóza se potvrzuje sérologickým testováním postižených osob. Použití kultivace je do značné míry omezeno na testování vzorků z prostředí k určení zdroje epidemie, ačkoli L. pneumophila séroskupiny 1 byla izolována z tracheálního aspirátu dítěte s horečkou Pontiac .

Závěry

Infekce způsobená bakterií Legionella je nepochybně nedostatečně rozpoznána. Diagnostika závisí na použití specializovaných testů, často v kombinaci. Testy na močové antigeny, kultivace sputa a testování PCR vzorků z dolních cest dýchacích jsou nejdůležitějšími diagnostickými nástroji pro odhalení infekce legionelou v časné fázi onemocnění. Vývoj testů močových antigenů, které detekují širší spektrum patogenních legionel, a vývoj standardizovaných testů PCR budou představovat významný pokrok v diagnostice legionel. Větší dostupnost a používání zdokonalených diagnostických testů pomůže lépe charakterizovat epidemiologii legionářské nemoci, včetně skutečného výskytu a geografické variability.

Poděkování

Jsem vděčný Stevu Chambersovi za užitečné připomínky k článku v rukopise.

.