Aerobní a anaerobní metabolismus u ryb s minimem kyslíku: Úloha alkoholdehydrogenázy | Journal of Experimental Biology

DISKUSE

Svítilny z Arabského moře a jejich příbuzní z Kalifornského proudu, Mexického zálivu a Antarktidy jsou silní vertikální migranti, kteří se pohybují ze středních hloubek (200-1000 m), kde tráví denní hodiny, v noci do vod blízko hladiny, kde se živí nejčastěji zooplanktonem (Pearcy et al., 1977; Gjøsaeter, 1984; Torres a Somero, 1988a; Lancraft a kol., 1989; Hopkins a Gartner, 1992; Luo a kol., 2000). Vertikální migrace je potravní strategií používanou světluškami po celém světě (Robinson et al., 2010), takže čtyři oblasti této studie byly přirozenými experimentálními systémy, které se výrazně lišily v profilech rozpuštěného kyslíku a teploty, ale jen velmi málo v denních zvyklostech běžných druhů. Pokusné objekty pro všechny čtyři regiony tak byly ekologickými analogy. Ve hře byly fyziologické reakce na dvě důležité fyzikální veličiny, kyslík a teplotu

V Arabském moři a Mexickém zálivu byl kyslík jednoznačně fyzikální proměnnou s největším vlivem. Teplotní profily v obou systémech byly prakticky totožné (obr. 1), ale profily kyslíku se radikálně lišily. V systému Arabského moře kyslík zmizel v hloubce 200 m a zůstal na nule až do hloubky 1000 m, zatímco v Mexickém zálivu kyslík ve stejném rozsahu klesl přibližně na polovinu povrchových hodnot (nasycení vzduchu) (obr. 1). V obou systémech se ryby během dne zdržovaly v kyslíkovém minimu. V Arabském moři by však myctophidy byly omezeny na anaerobii, ale v Mexickém zálivu byly koncentrace kyslíku v normoxickém rozmezí myctophidů (Donnelly a Torres, 1988). Biochemické strategie druhů, jak se vypořádat s příslušnými kyslíkovými profily, se odrážejí v jejich enzymatických aktivitách. LDH, koncový enzym glykolytické dráhy při anaerobióze, je u ryb z Arabského moře asi třikrát vyšší než u ryb z Mexického zálivu, což naznačuje silnou anaerobní schopnost (obr. 2). Naproti tomu mnohem vyšší aktivita CS u ryb Mexického zálivu ukazuje na vysoce aerobní strategii, kterou umožňuje mírné kyslíkové minimum vyskytující se v Mexickém zálivu. Aktivita ADH u ryb z Arabského moře byla také asi třikrát vyšší než aktivita pozorovaná u ryb z Mexického zálivu, což dává rybám biochemický mechanismus k přeměně laktátu, který nemůže být vyloučen žábrami, na etanol, který může být vyloučen (Shoubridge a Hochachka, 1980; Vornanen a kol., 2009).

Současný model přeměny laktátu na ethanol u zlatých rybek a kaprů (např. Shoubridge a Hochachka, 1980; Vornanen et al., 2009) vyžaduje, aby byl laktát nejprve oxidován na pyruvát za přítomnosti NADH, což je termodynamicky náročný krok (ΔG′°=+25,1 kJ mol-1) (Lehninger, 1970). Pyruvát je následně v mitochondrii přeměněn na acetaldehyd pomocí pyruvátdehydrogenázového komplexu, přičemž se uvolňuje CO2. Acetaldehyd je poté redukován na ethanol pomocí ADH za přítomnosti NADH (obr. 4). Biochemický mechanismus pro tvorbu ethanolu se nachází výhradně v plaveckém svalu, který zpracovává nejen laktát vznikající ve svalu, ale také laktát produkovaný jinými tkáněmi, jako je mozek, játra a srdce, a dodávaný do svalu krevním oběhem (Shoubridge a Hochachka, 1980; Vornanen a kol., 2009) (obr. 4). Aktivita ADH zjištěná ve svalu ryb z Arabského moře naznačuje podobnou strategii.

Kosterní sval ryb hraje důležitou roli při zpracování laktátu po cvičení prostřednictvím glukoneogenní a glykogenní dráhy, což je situace velmi odlišná od situace u savců, kde se enzymatický mechanismus pro regeneraci glukózy nachází především v játrech (Suarez a kol., 1986; Moon, 1988; Gleeson, 1996). Svalovina ryb je tedy multifunkčnější než svalovina savců, má širší škálu enzymů a větší vrozenou metabolickou flexibilitu než svalovina savců, včetně většího potenciálu pro biosyntézu (Gleeson, 1996). Bylo prokázáno, že rybí kosterní sval po cvičení sekvestruje laktát (Gleeson, 1996), což usnadňuje regeneraci glukózy ve svalu a zlepšuje regeneraci po cvičení. V případě zlaté rybky, karase obecného a nyní i lampionů umožňuje metabolická flexibilita souboru svalových enzymů nová biochemická řešení problému anaerobiózy.

Aktivita MDH byla také výrazně vyšší u ryb z Arabského moře než u ryb z Mexického zálivu, ale vzhledem k mnohočetným úlohám MDH v buňce je vysvětlení této skutečnosti podstatně méně jednoznačné. Svalová tkáň byla homogenizována pomocí homogenizátorů z mletého skla, což by umožnilo, aby v testovacím koktejlu byla aktivní jak cytosolová, tak mitochondriální MDH. Aktivity uvedené v tabulce 1 byly proto kombinací aktivity MDH z obou buněčných kompartmentů. V aerobním metabolismu je MDH jednoznačně důležitá jako enzym katalyzující tvorbu oxalacetátu v Krebsově cyklu. Kromě toho během aerobních podmínek pracují cytosolová a mitochondriální MDH v tandemu, aby přepravovaly redukční ekvivalenty vzniklé glykolýzou do mitochondrie ke zpracování v systému přenosu elektronů, což je nutnost vzhledem k nepropustnosti mitochondriální membrány pro cytosolový NADH. Třetí úloha MDH spočívá v katalýze důležitého kroku v konvenční glukoneogenní dráze. Jak už to tak bývá, u rybí svaloviny se předpokládá, že glukoneogeneze probíhá téměř přímým zvratem glykolýzy (Suarez et al., 1986; Moon, 1988; Gleeson, 1996) a MDH není důležitým účastníkem.

Je pravděpodobné, že MDH pomáhá udržovat redoxní rovnováhu v buňce během období přechodu z normoxických do anoxických podmínek, když ryby migrují směrem dolů do kyslíkového minima během dne a opět, když ryby migrují směrem nahoru k vyššímu obsahu kyslíku v povrchových vodách v noci. Malátový člun může přesouvat NADH buď do mitochondrie, nebo mimo ni v závislosti na potřebě redukční energie v buňce.

Rybí druhy z kalifornského pohraničí a Antarktidy vykazovaly podobné trendy jako jejich příbuzní z Arabského moře a Mexického zálivu s tím, že výsledky ovlivňovala teplota i kyslík. Electrona antarctica, nejsilnější a nejaktivnější vertikální migrant mezi antarktickými druhy, vykázal také nejvyšší aktivitu LDH, čímž antarktické druhy jako celek dosáhly výrazně vyšší hodnoty než druhy z Kalifornie při stejné teplotě testu. Vliv adaptace na teplotu u silně aktivní ryby (Torres a Somero, 1988b; Yang a Somero, 1993; Vetter a Lynn, 1997) je nejpravděpodobnějším vysvětlením její vysoké hodnoty. Pokud se aktivita LDH u ryby Electrona posuzuje při teplotě prostředí 0 °C, tedy při polovině hodnoty uvedené v tabulce 1 (54 U g-1 mokré hmotnosti), nachází se přesně uprostřed hodnot pro kalifornské druhy při 10 °C, což podtrhuje vzestupný vliv teplotní adaptace na aktivitu LDH u ryby Electrona. Aktivita CS ani MDH nevykazovala významné rozdíly mezi kalifornskými a antarktickými druhy při testovací teplotě 10 °C, ačkoli průměrné hodnoty pro kalifornské druhy byly v obou případech vyšší.

Aktivita ADH byla u kalifornských druhů významně vyšší i přes vliv testovací teploty, která by stejně jako u LDH měla tendenci zkreslovat antarktické hodnoty směrem nahoru. U ADH mělo nejpravděpodobnější vliv na celkovou aktivitu enzymu kalifornské kyslíkové minimum, které ve svém jádru (700 m; obr. 1) vykazuje hodnotu 0,2 ml l-1 . Vertikální migrace kalifornských lampionů by je přivedla k denním hodnotám kyslíku v rozmezí 0,5 až 1,0 ml l-1 (16-32 Torr, ∼2,1-4,2 kPa), což je hluboko pod jejich schopností účinně získávat kyslík (srov. Torres et al., 1979; Donnelly a Torres, 1988).

Svítivky z Arabského moře a kalifornského pohraničí se v denních hloubkách setkávají s nulovou až téměř nulovou koncentrací kyslíku poté, co během své exkurze směrem dolů uplavou nejméně 5000 délek těla (za předpokladu, že uplavou minimálně 300 m a délka těla je asi 5 cm; tabulka 1). Jejich energeticky nejefektivnějším řešením by bylo udržovat plaveckou aktivitu v rámci kyslíkového minima na co nejnižší úrovni, aby se minimalizovala potřeba anaerobiózy. Většina fakultativních anaerobů (např. mlži) (Hochachka, 1980; Hochachka a Somero, 2002) vykazuje během anaerobiózy výrazný pokles aktivity v důsledku vysokých energetických nákladů i těch nejúčinnějších anaerobních cest. Minimální aktivita minimalizuje spotřebu uložené energie. Ve spojení s využitím dráhy ADH by se také minimalizovala akumulace konečných produktů vylučováním ethanolu žábrami, a to vše při zachování redoxní rovnováhy ve svalových buňkách. Výlet vzhůru za soumraku do normoxických vod pak může být zahájen s relativně čistým „metabolickým štítem“, přičemž malátový člun pomáhá při přechodu, jak je popsáno výše.

Dielní vertikální migrace je adaptací, kterou kromě světlušek vykazuje mnoho druhů zooplanktonu a mikronektonu (Hopkins et al., 1994; Hopkins et al., 1996; Robinson et al., 2010), pravděpodobně kvůli minimalizaci vizuální predace. Vzhledem k tomu, že ostrost zraku a riziko napadení zrakovými predátory jsou během dne značně zvýšené, mnoho živočichů vstupuje do potravně bohatých povrchových vod pouze v noci a za svítání migruje do tmavších hloubek. Druhy sídlící v kyslíkových minimech nebo do nich migrující se vyrovnávají se stabilní fyzikální vlastností (Stramma et al., 2008), kterou lze řešit fyziologickou a biochemickou adaptací. V případě světlušek studovaných v této práci poskytuje kyslíkové minimum refugium před pelagickými predátory, kteří by v kyslíkových minimech Arabského moře nebo kalifornského příhraničí lovili se stejnými obtížemi jako v mrtvých zónách pobřežního oceánu.

Střednovodní ryby otevřeného oceánu se od pobřežních a sladkovodních ryb značně liší v načasování a charakteru svého vystavení nízkému nebo nulovému obsahu kyslíku. Nejdokonalejší rybí anaerobik (a nejlépe prozkoumaný), karas obecný, podstupuje během zimních měsíců ve svém původním prostředí ve střední Asii a Evropě předvídatelný pobyt při nulovém obsahu kyslíku (Vornanen a Paajanen, 2004). Jedinci obývající malé eutrofní rybníky přezimují pod ledovou a sněhovou pokrývkou, která znemožňuje výměnu atmosférických látek, což vede k obdobím anoxie, která mohou trvat 90 i více dní (Piironen a Holopainen, 1986). Skutečnost, že vystavení anoxii je sezónní událostí, umožňuje, aby metabolické a morfologické přizpůsobení proběhlo před poklesem kyslíku v prostředí. Metabolické přizpůsobení zahrnuje akumulaci glykogenu v játrech, svalech, mozku a srdci jako paliva pro potřebu anaerobní aktivity. Morfologické přizpůsobení zahrnuje zvýšení počtu žaberních lamel, což vede k sedminásobnému zvětšení povrchu žaber (Vornanen et al., 2009), aby se usnadnila výměna kyslíku. Snad nejpřekvapivější je skutečnost, že srdce a mozek karase obecného zůstávají během anoxie plně funkční, což je strategie, která je mezi obratlovci jedinečná a umožňuje, aby etanol vyplavovaný ze svalových tkání byl dodáván k vylučování do žaber a aby glukóza byla distribuována ze zásob v játrech na potřebná místa (Vornanen et al., 2009).

Pobřežní mořské ryby se setkávají s hypoxií v různých přírodních i antropogenně ovlivněných situacích. Přílivové tůně nebo kanály v oblastech s rozkládající se vegetací, jako jsou mangrovové porosty, nebo v mezipřílivových oblastech s organicky bohatým bahnem mohou při odlivu procházet anoxií, což někdy vystavuje původní druhy sulfidům (Bagarinao a Vetter, 1989; Graham, 1997; Geiger a kol., 2000). U ryb, které jsou k tomu vybaveny, je dýchání vzduchem vhodnou možností, jak minimalizovat účinky anoxie a vystavení sulfidům (Graham, 1997; Geiger et al., 2000). Jiné využívají biochemickou možnost mitochondriální oxidace sulfidu k minimalizaci jeho toxických účinků, podobně jako druhy u hydrotermálních vývěrů (Bagarinao a Vetter, 1989). Ve většině přirozeně se vyskytujících hypoxických systémů jsou exkurze na nulovou hladinu kyslíku buď epizodické, jako v mangrovových přílivových tůních, nebo k nim dochází pravidelně při odlivu během teplejších měsíců roku. Tyto situace jsou předvídatelné a dostatečně časté, aby se jim dalo přizpůsobit fyziologickou adaptací. Druhy, které žijí v prostředí vystaveném přirozené hypoxii, jsou fyziologicky připraveny se s ní vypořádat.

V pobřežních oceánech a zátokách Severní Ameriky, Evropy a Asie se s větší pravidelností vyskytují antropogenně vyvolané nebo zesílené hypoxické jevy neboli mrtvé zóny (Diaz a Rosenberg, 2008). Mrtvé zóny jsou obvykle spojeny s únikem živin a letní stratifikací v mělkých mořských systémech (Diaz a Breitburg, 2009; Rabalais a kol., 2002). Zatížení živinami urychluje produkci a míchání atmosférického kyslíku je brzděno stratifikací vodního sloupce. Pod smíšenou vrstvou dochází k mikrobiálnímu rozkladu potápějících se organických látek, který značně vyčerpává kyslík a v některých případech zbavuje dno a stanoviště v blízkosti dna veškeré hodnoty (Diaz a Breitburg, 2009). Přežití ryb v hypoxických zónách závisí na účinnosti druhů při odstraňování kyslíku při sníženém PO2 (Chapman a McKenzie, 2009; Perry a kol., 2009; Richards, 2009), která se u jednotlivých taxonů značně liší (Richards, 2009). V žádném případě není dlouhodobá anaerobióza využívána rybami jako strategie vyrovnávání se s mrtvými zónami.

Pokud je ve vodě malé, ale stálé množství kyslíku, například v zóně kyslíkového minima, živočichové si vyvinuli mechanismy pro jeho získávání a využívání. Třemi mechanismy jsou zvětšená plocha žaber, účinný oběhový systém a krevní barvivo s vysokou afinitou. U ryb, které obývají vrstvu kyslíkového minima Kalifornského proudu, byla naměřena velká plocha žaber (Ebeling a Weed, 1963; Gibbs a Hurwitz, 1967). Gnathophausia ingens, lophogastridní korýš žijící v této oblasti, má kromě vysoce vyvinutých žaber a účinného oběhového systému (Childress, 1971; Belman a Childress, 1976) také vysoce afinitní hemocyanin s velkým pozitivním Bohrovým efektem a vysokou kooperativitou. Je schopen načítat kyslík při parciálním tlaku 6 torrů (∼0,8 kPa); jeho vysoká kooperativita umožňuje pigmentu vyložit kyslík v tkáních přes velmi malý difuzní gradient (Sanders a Childress, 1990).

Svítivky tvoří zvláštní, panglobální čeleď pelagických ryb, z nichž velká většina jsou vertikální migranti (Nelson, 2006; Smith a Heemstra, 1991). Jejich geografické rozšíření zahrnuje všechna závažná oceánská kyslíková minima, z nichž dvě byla zpracována v této studii. Navrhujeme, že namísto využití strategie těch druhů, které zůstávají trvale v nejtěžších částech vrstvy kyslíkového minima, což vyžaduje značné fyziologické a morfologické investice (Childress a Seibel, 1998), jsou schopny využívat dráhu ADH k minimalizaci akumulace koncových produktů a zároveň po část dne využívat anaerobiózu ke zvládnutí nároků kyslíkového minima. Tato anaerobní strategie připomíná strategii, kterou využívají přílivové druhy během odlivu (srov. Hochachka, 1980; Torres et al., 1977), ale její výhodou je předvídatelnější a kontrolovatelnější vstup do nízkého obsahu kyslíku. Toto je první zpráva o aktivitě ADH ve svalovině jiných ryb než zlaté rybky a kapra, což je do značné míry nepřehlédnutelná anaerobní strategie, která může být rozšířenější.